New strategy to enhance the byosynthesis of bioactive compounds produced in Rhizopus fermented soybean : recovery of bioactive compounds by conventional organic solvents, supercritical CO2 and evaluation of their potentional activities

Abstract

Resumo: A busca por alternativas terapêuticas vem crescendo e ganhando destaque cada vez mais nos dias atuais. Uma das estratégias consiste no consumo de alimentos que são ricos em antioxidantes naturais e outros compostos bioativos que apresentam capacidade de prevenir ou reduzir processos patogênicos associados a doenças metabólicas. Devido à presença de muitos compostos com propriedades bioativas, incluindo antioxidantes, os alimentos fermentados são relacionados a uma série de efeitos benéficos para a saúde e surgem como uma alternativa promissora. A fermentação tem sido utilizada como uma forma potente de melhorar as propriedades da soja e dos seus componentes. Neste contexto, este estudo teve como objetivo em um primeira etapa avaliar o uso de diferentes substratos a fim de aumentar a produção de compostos bioativos através do bioprocessamento da soja por Rhizopus oligosporus NRRL 2710, e por seguinte comparar os rendimentos obtidos de diferentes métodos, nomeadamente Soxhlet e CO2 + cosolvente supercrítico. A suplementação soja + arroz integral mostrou um aumento significativo na concentração de compostos fenólicos, expressa como equivalente á ácido gálico (GAE), (0,697 a 6,447 mg GAE g-1) em comparação com o uso apenas da soja (1,792 a 3,10 mg GAE g-1). Tal processo resultou em um produto rico em isoflavona e aglycone, contendo diferentes compostos antioxidantes, tais como ácido transcinâmico, ácido gálico, miricetina, quercetina e kaempferol. O substrato fermentado também mostrou grande potencial para inibir a enzima hialuronidase (actividade antiinflamatória) e contra o crescimento de células tumorais CaCo-2 (actividade antitumoral). O Soxhlet foi utilizado como método de extracção de referência para efeitos de comparação; foi realizado com 7 solventes orgânicos incluindo n-hexano, éter de petróleo, acetato de etilo, acetona, etanol, metanol e água. Para a extracção de Soxhlet, os rendimentos mais altos e mais baixos obtidos foram 45,24% e 15,56% utilizando metanol e hexano, respectivamente. Além disso, foi alcançado um aumento de 18,62% no rendimento da extracção quando a soja fermentada foi seca antes das extracções. A extracção utilizando CO2 supercrítico mais etanol como modificador estático (scCO2 + EtOH) apresentou, a alta pressão (25 MPa) e temperatura (80°C), um teor de compostos fenólicos de 1391,9 µg GAE g-1 e eliminação radical de 0,17 g g g-1, atingindo um rendimento de 42,87%. Todos os extractos mostraram actividade anti-inflamatória contra a enzima hialuronidase e os compostos bioactivos identificados por HPLC-DAD, incluindo ácido gálico, ácido transcinâmico, daidzeína e genisteína. Estes resultados mostraram que o produto obtido pode servir como um ingrediente de valor agregado para a industria alimenticia e farmaceutica e que as técnicas de extração utilizadas foram eficientes no rendimento do processo e os solventes de maior polaridade têm uma influência significativa. Foi também demonstrada a viabilidade técnica da scCO2 + EtOH para obter um produto de alto valor agregado.

Abstract: The search for therapeutic alternatives has been growing and gaining prominence more and more these days. One of the strategies is the consumption of foods that are rich in natural antioxidants and other bioactive compounds that have the capacity to prevent or reduce pathogenic processes. Due to the presence of many compounds with bioactive properties, including antioxidants, fermented foods are related to a number of beneficial health effects and emerge as a promising alternative. Fermentation has been used as a potent way of improving the properties of soybean and their components. In this context, this study aimed in a first step to evaluate the use of different substrates in order to increase the production of bioactive compounds through the bioprocessing of soybean by Rhizopus oligosporus NRRL 2710, and next to compare the yields obtained from different methods, namely Soxhlet and CO2 + supercritical solvent. The soy + brown rice supplementation showed a significant increase in the concentration of phenolic compounds, expressed as gallic acid equivalent (GAE), (0.697 to 6.447 mg GAE g-1) compared to using soy alone (1.792 to 3.10 mg GAE g-1). Such a process resulted in a product rich in isoflavone and aglycone, containing different antioxidant compounds such as trans-cinnamic acid, gallic acid, myricetin, quercetin and kaempferol. Soxhlet was used as a reference extraction method for comparison purposes; it was performed with 7 organic solvents including n-hexane, petroleum ether, ethyl acetate, acetone, ethanol, methanol, and water. For Soxhlet extraction, the highest and lowest yields obtained were 45.24% and 15.56% using methanol and hexane, respectively. In addition, an increase of 18.62% in extraction yield was achieved when fermented soybeans were dried before extractions. Extraction using supercritical CO2 plus ethanol as a static modifier (scCO2 + EtOH) showed, at high pressure (25 MPa) and temperature (80°C), a phenolic compound content of 1391.9 µg GAE g-1 and radical elimination of 0.17 g g g-1, achieving a yield of 42.87%. All extracts showed anti-inflammatory activity against hyaluronidase enzyme and bioactive compounds identified by HPLC-DAD, including gallic acid, transcinnamic acid, daidzein and genistein. These results showed that the product obtained can serve as a value-added ingredient for the food and pharmaceutical industries and that the extraction techniques used were efficient in yielding the process and the higher polarity solvents have a significant influence. The technical feasibility of scCO2 + EtOH to obtain a high value-added product was also demonstrated.