Indole-3-acetic acid producing endophytic bacteria with potential to be applied as bioinoculant

Abstract

Resumo: Bactérias endofíticas têm a característica única de entrar e colonizar os tecidos das plantas e manter uma interação benéfica com o hospedeiro. São responsáveis direta e indiretamente por diversas características relacionadas à nutrição e defesa do crescimento das plantas. Bactérias endofíticas produtoras de auxina podem ser potencialmente usadas como bioinoculantes para promoção de crescimento de plantas. Neste trabalho, foi realizada a análise da diversidade das bactérias endofíticas de folhas de Eucalyptus urophylla AEC224 in vitro a partir da metagenômica e posteriormente isolados por método dependente de cultura, para obtenção de isolados com habilidades de promoção de crescimento de plantas. Das estirpes isoladas, as duas maiores produtoras de auxina foram identificadas como Enterobacter sp. e Paenibacillus polymyxa por 16S rDNA. As cepas isoladas e em conjunto com outra bactéria endofítica Bacillus megaterium DEBB B-353, foram avaliadas para a produção de IAA, avaliando os componentes dos meios de cultura e otimização do processo, escalonamento e aplicação no crescimento de plantas. Entre os parâmetros avaliados, o pH à 5±0.2, a água de maceração de milho (milhocina) e o glicerol foram escolhidos como fontes de nitrogênio e carbono. A melhor concentração de triptofano variou entre 1030 a 1250 µg.mL-1, porcentagem de inóculo de 3,5 à 4%. A maior produção de IAA do isolado Enterobacter sp. DEBB B-355 foi de 824.09 µg.mL-1, obtida em frascos após 96 h de cultura, 750.05 µg.mL-1 em biorreator de 2 L e aumentou para 910.27 µg.mL-1 quando escalonado para biorreator de 10 L, após 128 h. O rendimento de produção de IAA com o B. megaterium foi de 672.15 µg.mL-1 em frascos, 750.61 µg.mL-1 e 639.45 µg.mL-1 em biorreatores de 2 L e 10 L, respectivamente. As produções otimizadas do isolado P. polymyxa promoveram um rendimento de IAA de 725.01 µg.mL-1 em frascos, 567.18 µg.mL-1 em biorreator de 2 L e teve um incremento para 812.49 µg.mL-1 usando o biorreator de 10 L. Após o escalonamento, a produção de IAA reduziu de 72 para 32 h para B. megaterium e P. polymyxa. A síntese do IAA pelos isolados foi confirmada por HPLC e FTIR. A biomassa bacteriana e o sobrenadante com as auxinas produzidas demonstraram promover a germinação de sementes e o desenvolvimento de plantas e raízes. Além disso, foi desenvolvido um meio de baixo custo usando a milhocina e o glicerol como os principais componentes do meio de cultivo. A produção de AIA obtida para as estirpes de B. megaterium e P. polymyxa, foi superior em relação a toda produção de IAA já reportada em outros estudos. Por fim, nanopartículas mono e bimetálicas de Fe e Mn obtidas por um método simples e rápido, utilizando-se o sobrenadante de cultivo bacteriano contendo o complexo de auxinas (AIA) foram avaliadas como nano fertilizantes de plantas. A biossíntese das nano-partículas de FeOx-NPs, MnOx-NPs e bimetálicas MnOx/ FeOx-NPs foi bem sucedida, conforme observado pelas técnicas de espectroscopia UV/Vis, MET e FTIR. As NPs aumentaram as taxas de germinação, o crescimento das raízes, assim como o peso fresco de mudas de milho e mostraram se adequadas para serem utilizadas como nano-fertilizantes de micronutrientes.

Abstract: Endophytic bacteria have the unique characteristic of entering and colonizing plant tissues and maintaining a beneficial interaction with the host. They are directly and indirectly responsible for several characteristics related to plant nutrition and defense. Auxin-producing endophytic bacteria can potentially be used as bioinoculants to promote plant growth. In this work, an analysis of the diversity of endophytic bacteria from Eucalyptus urophylla AEC224 leaves was performed in vitro from the metagenomics and later isolated by culture-dependent method, to obtain isolates with plant growth promotion abilities. From the isolated strains, two major auxin producers were identified as Enterobacter sp. and Paenibacillus polymyxa by 16S rDNA. Both isolated strains and another endophytic strain Bacillus megaterium DEBB B-353, were evaluated for IAA production, evaluating culture medium components and optimization of the process, scale-up and application in plant growth. Among the parameters evaluated, the pH at 5 ± 0.2, corn steep liquor (CSL) and glycerol were chosen as sources of nitrogen and carbon. The best tryptophan concentration varied between 1030 to 1250 µg.mL-1, percentage of inoculum from 3.5 to 4%. The highest production of IAA from Enterobacter sp. was 824.09 µg.mL-1 in flasks after 96 h of culture, 750.05 µg.mL-1 in a 2 L bioreactor and increased to 910.27 µg.mL-1 when scaled to a 10 L bioreactor, after 128 h. The yield of IAA production with B. megaterium was 672.15 µg.mL-1 in flasks, 750.61 µg.mL-1 and 639.45 µg.mL-1 in 2 L and 10 L bioreactors. Optimization of the P. polymyxa isolate promoted an IAA yield of 725.01 µg.mL-1 in flasks, 567.18 µg.mL-1 in a 2 L bioreactor and increased to 812.49 µg.mL-1 using the bioreactor 10 L. After scale-up, the peak of IAA production decreased from 72 to 32 h for B. megaterium and P. polymyxa. The synthesis of IAA by the isolates was confirmed by HPLC and FTIR. Bacterial biomass and the supernatant with the produced auxins showed positive promotion on seed germination and plants and root development. So far, a low-cost medium was developed using CSL and glycerol as the main components of the culture medium. And, the results obtained for the strains B. megaterium and P. polymyxa, were higher in relation to all IAA production previously reported in other studies. Finally, the synthesis of mono and bimetallic nanoparticles of Fe and Mn was evaluated by a simple and fast method, using the bacterial culture supernatant containing the auxin complex (IAA), and evaluated as plant nano fertilizers. The biosynthesis of FeOx-NPs, MnOx-NPs and bimetallic MnOx/FeOx-NPs nano-particles was successful, confirmed by the techniques of UV/Vis spectroscopy, TEM and FTIR. NPs increased germination rates, root growth as well as fresh weight of corn seedlings and proved to be suitable for use as micronutrient nano-fertilizers.