The antioxidant power extract of Ganoderma lucidum spores : a potencial coadjuvant for reproductive cells survival

Abstract

Resumo: Ganoderma lucidum é um fungo usado na medicina tradicional chinesa. Este cogumelo é conhecido mundialmente pelos efeitos antioxidantes e terapêuticos contra várias doenças. A ação biológica tem sido relacionada na literatura com diferentes estruturas de fenóis, flavonóides, lipídios e carboidratos. Neste trabalho estudamos os efeitos de vários extratos aquosos preparados a partir de esporos de G. lucidum nas células reprodutivas (oócitos e espermatozoides). Para melhor compreensão o desenvolvimento deste trabalho foi baseado na proposição de um fluxograma de trabalho contendo 7 pasos. O passo 1 consiste duma revisão da literatura sobre G. lucidum mais especificamente abordando sua taxonomia, moléculas bioativas e seus componentes químicos gerais. No passo 2 é elaborado um extrato aquoso e avaliado a citotoxicidade dos esporos de G. lucidum em cultura in vitro de folículos pré-antrais. A sobrevivência celular não diferiu estatisticamente quando comparada com os grupos controle. O passo 3 do processo teve como objetivo realizar a caracterização dos extratos por diferentes metodologias de extração de substâncias antioxidantes dos esporos do fungo. As metodologias avaliadas foram: disruptor celular de ultrassom, micro-ondas, Soxhlet e maceração. O poder antioxidante foi avaliado por 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) em uma curva de ácido ascórbico (µM AA). A melhor atividade antioxidante se obteve para a metodologia de micro-ondas, pois teve um poder antioxidante de 100,60 ± 0,01 µM AA, e a metodologia de maceração teve um poder de 67,57 ± 0,06 µM AA. No passo 4 foi realizada a otimização de metodologias de extração de substâncias bioativas. Os esporos de G. lucidum foram rompidos com esferas de aço / crômio de 1 mm de diâmetro durante 10 minutos de maceração (97,48% de rompimento). Após rompimento, foi feita uma extração aquosa por agitação (extrato BR) e uma extração adicional que incluiu exposição a micro-ondas antes da extração (extrato MBR1). A extração aquosa foi realizada à temperatura de 30 °C e agitação de 120 rotações por minuto (rpm) por 24 h. O extrato MBR1 apresentou o maior teor de polifenóis (2,21 ± 0,01 mg / 1 g de esporos de Ganoderma) e carboidratos com alto teor de glucose (77,73%). No passo 5 foi realizada maior purificação dos extratos BR e MBR1. A razão da escolha destes extratos foi pela amostra BR, pois a metodologia produz o maior conteúdo de proteinas na análise por dodecil-sulfato de sódio de poliacrilamida (SDS PAGE), e o MBR1 por possuir o maior conteúdo de carboidratos e a maior quantidade de mg extraídos dos esporos. O resíduo dos esporos foi exposto a diferentes temperaturas (60, 90 e 100 °C) e seguido de diálise (membrana de 12 - 14 kDa) obtendo-se as frações eluídas BR2 e MBR2 e as frações retidas BR1 e MBR1. Os extratos BR1, MBR1 e MBR2 apresentaram carboidratos do tipo glucana. A fração MBR2 foi a única a apresentar glucanas de baixo peso molecular a e a fração BR2 foi a única com maior conteúdo de bandas proteicas (análise feita pela SDS PAGE). No passo 6 do algoritmo foi realizada a avaliação da atividade biológica. O extrato aquoso de esporos de G. lucidum adicionado à cultura in vitro de folículos pré-antrais estimulou o crescimento folicular, pois aumentou o diâmetro folicular (38,36 ± 05,03 µm) e o diâmetro do oócito (24,60 ± 03,48 µm). Por outro lado, a adição da fração MBR2 no teste antioxidante em espermatozóides permitiu manter a viabilidade celular (19,20 ± 0,13 %). A atividade mais importante dos extratos de G. lucidum foi a ação antioxidante. Os extratos de esporos ajudam manter o equilíbrio osmótico celular nos meios de cultura, porque seus carboidratos ajudam controlar os radicais livres e, seus micros - e macros-nutrientes (Na, K, Ca, Mn, Mg, P) podem fornecer maior apoio à viabilidade celular. Finalmente, o passo 7 descreve as aplicações em medicina, em que o extrato MBR2 com glucanas 1,4-a de baixo peso molecular podem proteger a membrana celular da peroxidação lipídica. No entanto, para confirmação destes resultados são necessários mais estudos para purificar e descrever este tipo de carboidratos. Em conclusão, os extratos de G. lucidum podem ser adicionados como adjuvantes aos meios de cultura celular porque seu poder antioxidante é tão eficaz como o ácido ascórbico.

Abstract: Ganoderma lucidum is a fungus used in traditional Chinese medicine. This mushroom is known worldwide for its antioxidant and therapeutic effects against several diseases. The biological action has been related, according to the literature, with different structures of phenols, flavonoids, lipids and carbohydrates. In this work we studied the effects of several aqueous extracts prepared from fungal spores on reproductive cells (oocytes and sperm). To achieve the proposed goal an algorithm was here constructed and seven steps were worked. The step 1 a literature review about G. lucidum specially its taxonomy, the bioactive molecules and their general chemical components. In the step 2 we prepared aqueous extract and evaluated their cytotoxicity based in the biotechnique of manipulationn of oocytes enclosed in preantral follicles (MOEPF). Cell survival had no statistical differences when compared to the control groups showing that this extract lack of cytotoxicity. In the step 3 was made an extracts characterization using different extraction methodologies and the antioxidant fungus spores power. The best antioxidant value was exposure of the spores to microwaves with 100.60 ± 0.01 µM ascorbic acid (AA) and maceration with 67.57 ± 0.06 µM AA. In the step 4 was done the extraction methodologies otimization. The spores of G. lucidum were broken using 1 mm diameter Steel / chrome spheres during 10 min of maceration (97.48 % breakage). After the breakage was made an aqueous extraction by agitation (BR extract) and a further extraction that included exposure to microwaves before extraction (MBR1 extract). The aqueous extraction was carried out at a temperature of 30 °C and stirring at 120 rpm (revolutions per minute) for 24 h. The MBR1 extract presented the highest content of polyphenols (2.21 ± 0.01 mg / 1 g Ganoderma spores) and carbohydrates with high glucose content (77.73%). In the step 5 a new purification of the extracts BR and MBR1 was carried out. BR was chosen because it presented the largest number of protein bands by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) analysis. MBR1 was chosen because it had the highest carbohydrate content and the highest amount of extract produced. The residue of the spores was exposed to different temperatures (60, 90 and 100 °C) and dialysis was carried out (membrane of 12 - 14 kDa) obtaining the eluted fractions BR2 and MBR2 and the retained fractions BR1 and MBR1. The extracts BR1, MBR1 and MBR2 presented glucan-type carbohydrates. The MBR2 fraction was the only one to present a low molecular weight glucans and the BR2 fraction was the only one with the highest content of protein bands (analysis done by SDS PAGE). The step 6 was the evaluation of biological activity. The aqueous extract of G. lucidum spores that was added to the in vitro culture of preantral follicles stimulated the follicular growth; because, it increased the follicular diameter (38.36 ± 05.03 µm) and oocyte diameter (24.60 ± 03.48 µm). On the other hand, the addition of the MBR2 fraction in the antioxidant test in spermatozoa allowed cell viability to be maintained (19.20 ± 0.13 %). The most important activity of the extracts of G. lucidum was the antioxidant action. Spore extracts were useful to maintain cell osmotic balance in culture media; because their carbohydrates help control free radicals and because their micro- and macronutrients (Na, K, Ca, Mn, Mg, P) can provide greater support for cell viability. Finally in the step 7, the MBR2 fraction was partially characterized and explained because its 1.4-a glucan has effects against lipid peroxidation of the cell membrane. However, more studies are needed to purify and describe this type of carbohydrate. A general conclusion, G. lucidum extracts can be added as adjuvants to cell culture media because their antioxidant power is as effective as ascorbic acid.

Resumen: Ganoderma lucidum es un hongo utilizado en la medicina tradicional china. Este hongo es conocido en todo el mundo por sus efectos antioxidantes y terapéuticos contra varias enfermedades. La acción biológica se ha relacionado, según la literatura, con diferentes estructuras de fenoles, flavonoides, lípidos y carbohidratos. En este trabajo se estudiaron los efectos en las células reproductivas (ovocitos y espermatozoides) de varios extractos acuosos preparados a partir de esporas de G. lucidum. Para este objetivo se propuso un algoritmo y se trabajaron 7 pasos. En el paso 1 se hizó una revisión de la literatura sobre G. lucidum, donde se describe su taxonomía, las moléculas bioactivas y sus componentes químicos. En el paso 2 se preparó un extracto acuoso y se evaluó su citotoxicidad teniendo como base la biotecnología de manipulación de ovocitos incluidos en folículos preantrales (MOIFOPA). El resultado sobre la supervivencia celular no presento diferencias estadísticas cuando se comparó con los grupos control, lo que muestra que este extracto carece de citotoxicidad. En el paso 3 se desarrollaron diferentes metodologías de extracción del poder antioxidante de las esporas de G. lucidum y se evaluaron. El mejor valor antioxidante fue la exposición de las esporas a microondas con 100,60 ± 0,01 µM de ácido ascórbico (AA) y la maceración con 67,57 ± 0,06 µM de AA. En paso 4 se realizó la optimización de las metodologías de extracción. Las esporas de G. lucidum se rompieron utilizando esferas de acero/cromo de 1 mm de diámetro durante 10 minutos de maceración (97,48 % de rotura). Después del rompimiento se hizó una extracción acuosa por agitación (extracto de BR) y otra extracción que incluyó la exposición a microondas antes de la extracción (extracto de MBR1). Todas estas extracciones se realizaron a una temperatura de 30 °C se mantuvieron en agitación a 120 rpm (revoluciones por minuto) durante 24 h. El extracto MBR1 presentó el mayor contenido de polifenoles (2,21 ± 0,01 mg / 1 g de esporas de Ganoderma) y carbohidratos con alto contenido en glucosa (77,73%). En el paso 5 se llevó a cabo una mayor purificación de los extractos BR y MBR1. Se eligió el extracto BR porque presentaba el mayor número de bandas de proteínas (analizado con sodio dodecil sulfato de poliacrilamida en gel -SDS PAGE). También, el extracto MBR1 fue elegido porque tenía el mayor contenido de carbohidratos y la mayor cantidad de extracto producido. El residuo de las esporas fue expuesto a diferentes temperaturas (60, 90 y 100 °C) y se realizó diálisis (membrana de 12 - 14 kDa) obteniendo las fracciones eluidas BR2 y MBR2 y las fracciones retenidas BR1 y MBR1. Los extractos BR1, MBR1 y MBR2 presentaron carbohidratos tipo glucano. La fracción MBR2 fue la única que presentó glucanos de bajo peso molecular y la fracción BR2 fue la única con el mayor contenido de bandas de proteínas (análisis realizado por SDS PAGE). El paso 6 del algoritmo fue la evaluación de la actividad biológica. El extracto acuoso de esporas de G. lucidum que se adiciono al cultivo in vitro de folículos preantrales estimulóel crecimiento folicular, ya que aumentó el diámetro folicular (38,36 ± 05,03 µm) y el diámetro del ovocito (24,60 ± 03,48 µm). Por otro lado, la adición de la fracción MBR2 en la prueba antioxidante en espermatozoides permitió mantener la viabilidad celular (19,20 ± 0,13 %). La actividad más importante de los extractos de G. lucidum fue la acción antioxidante. Los extractos de las esporas fueron útiles para mantener el equilibrio osmótico celular en los medios de cultivo; porque sus carbohidratos ayudan a controlar los radicales libres y porque sus micro y macronutrientes (Na, K, Ca, Mn, Mn, Mg, P) pueden proporcionar un mayor apoyo a la viabilidad celular. finalmente, el paso 7, donde se caracteriza y explica la fracción MBR2, ya que su glucano 1,4-a tiene efectos contra la peroxidación lipídica de la membrana celular. Sin embargo, se necesitan más estudios para purificar y describir este tipo de carbohidratos. Como conclusión general, los extractos de G. lucidum pueden añadirse como adyuvantes a los medios de cultivo celular porque su poder antioxidante es tan efectivo como el ácido ascórbico.