Caracterização funcional da proteína CCCH zinc finger TcZC3H24 de Trypanosoma cruzi

Abstract

Resumo: O Trypanosoma cruzi, protozoário causador da doença de Chagas, possui um ciclo de vida complexo, cujo controle de seus eventos celulares operam essencialmente em nível pós-transcricional. Esta regulação gênica compreende diversos fatores regulatórios desconhecidos que atuam principalmente na modulação da estabilidade de mRNAs, seu transporte e acessibilidade à maquinaria traducional. Esta atividade reguladora compreende a interação de fatores em trans, compostos principalmente por proteínas de ligação ao RNA, a elementos regulatórios em cis presentes nas moléculas dos mRNAs. Entre as proteínas de ligação ao RNA, estão as proteínas com motivo CCCH Zinc Finger, pouco compreendidas em T. cruzi. Com o objetivo de caracterizar uma proteína CCCH, nomeada TcZC3H24, foram utilizadas abordagens de genética reversa, empregando-se vetores de expressão ectópica, cassetes tradicionais de knockout e a ferramenta CRISPR/Cas9. O gene TcZC3H24 codifica uma proteína de 28,7 Kda, o qual possui em sua fração carboxi terminal um domínio C-X8-C-X5-C-X3- H. Esta proteína é expressa em todos os estágios de desenvolvimento do parasita e possui um perfil granular irregularmente distribuída no citoplasma nas formas pimastigota, tripomastigota metacíclico, amastigota e tripomastigota sanguíneo. A superexpressão de TcZC3H24 não alterou o crescimento celular e a capacidade de diferenciação in vitro das formas epimastigotas em tripomastigotas metacíclicos. O knockout nulo de TcZC3H24 não perturbou o crescimento dos parasitas, porém acelerou o processo de diferenciação in vitro para as formas parasitárias infectantes humanas, além de resultar no aumento da taxa de tripomastigotas metacíclicos no sobrenadante do meio de cultivo. A complementação dos mutantes nulos reverteu o fenótipo observado, sugerindo a função de TcZC3H24 na regulação negativa da metaciclogênese, fato que viabiliza um melhor entendimento da via de regulação gênica estágio-específica do T. cruzi.

Abstract: Trypanosoma cruzi, a protozoan that causes Chagas disease, has a complex life cycle whose control of its cellular events essentially operates at the post-transcriptional level. The gene regulation comprises several unknown regulatory factors that act mainly on the modulation of mRNAs stability, their transport and accessibility to the translation machinery. This regulatory activity involves the interaction of trans factors, composed mainly by RNA binding proteins, to cis-regulatory elements present in mRNA molecules. Among the RNA binding proteins, we can mention CCCH Zinc Finger proteins, which are poorly understood in T. cruzi. In order to characterize a CCCH protein named TcZC3H24 we used reverse genetics techniques employing ectopic expression vectors, traditional knockout cassettes and the CRISPR/Cas9 system. The TcZC3H24 gene encodes an 28,7 Kda protein, which has in its carboxy terminal a C-X8-C-X5-C-X3-H domain. This protein is expressed at all parasite's stages and it is irregularly distributed in the cytoplasm of epimastigote, metacyclic, amastigote and trypomastigote forms in a granular pattern. TcZC3H24 overexpression did not disturbed cell growth and in vitro differentiation of epimastigotes into metacyclics forms. The null knockout of TcZC3H24 did not disturbed parasite growth but it accelerated in vitro differentiation into the human-infective metacyclic form and increasead the rate of metacyclic in cell culture supernatant. Complementing null mutants reversed the observed phenotype, suggesting the role of TcZC3H24 in metacyclogenesis negative regulation. This fact allows better understanding of stage-specific gene regulation in T. cruzi.