Tecnologia no waste para a produção de polihidroxialcanoatos a partir de substratos alternativos
Resumo
Resumo: As atuais problemáticas ambientais requerem urgentemente a aplicação de tecnologias e conhecimento para encontrar soluções que viabilizem a continuidade dos processos produtivos de forma sustentável. Biorrefinarias baseadas na cadeia produtiva da soja (Glycine max) têm sido estudadas e apresentam boas perspectivas para a geração de biomoléculas de médio e alto valor agregado. Neste contexto, o presente projeto teve como objetivo o aproveitamento de resíduos agroindustriais gerados em grandes quantidades no território brasileiro, neste caso a casca de soja e o glicerol residual, para a produção biotecnológica de biopolímeros, especificamente os polihidroxialcanoatos (PHA). Este trabalho faz parte do projeto BRICS-BEST CNPq/ MCTIC/BRICS-STI Nº 18/2016 proposta 271. A primeira parte deste trabalho tem como foco a revisão e análise das tecnologias, avanços e desafios relacionados com a produção de polihidroxialcanoatos microbianos a partir de hidrolisados de biomassa lignocelulósica. Por sua vez, a segunda parte deste estudo descreve a implementação da casca de soja e do glicerol residual como fontes de carbono para a produção de PHA. Assim, com o intuito de explorar a alternativa de valorizar resíduos agroindustriais do território brasileiro presentes em grandes quantidades, para a produção de PHA, desenvolveram-se as etapas de caracterização estrutural da casca de soja para depois definir, de a cordo com a composição encontrada (celulose 31,0 ± 1,6%; hemicelulose 11,8 ± 1,3%; lignina 6,18 ± 0,8%; proteínas 10,5%; extrativos 9,3 ± 1,0%; cinzas 3,6 ± 0,03%; umidade 6,0 ± 0,10%; outros 21,62%), a escolha do melhor tratamento para a recuperação dos açúcares presentes no material lignocelulósico. A bioconversão da biomassa lignocelulósica em biopolímeros envolve três grandes operações unitárias de up-stream: prétratamento do material, sacarificação e fermentação. Desta forma, para a primeira etapa foi definido um pré-tratamento alcalino [NaOH 2% (m/v)] do substrato [10% (m/v)] em condições brandas (60 min - 121°C - 1 atm.). Para o processo de sacarificação, implementou-se um coquetel enzimático não comercial, composto por complexos de celulase (B1), xilanase (B1- XylA), e por B-glucosidase (F10). Desenvolveu-se a otimização das condições do processo implementando a Metodologia de Superfície de Resposta baseada na ferramenta de Desenho Composto Central, onde foram consideradas as variáveis de concentração enzimática, concentração de substrato e tempo de processamento. Como resultado, na melhor condição da otimização foi obtido um hidrolisado com 115,9 g·L-1 de açúcares redutores, adicionando 62% (m/v) de casca de soja pré-tratada, com tempo de processamento de 42h e com a carga enzimática da enzima B1 correspondente a 11,52 mg proteína.g-1 biomassa seca, da enzima B1- XylA de 2,88 mg proteína.g-1 biomassa seca e da enzima F10 de 57,59 U/g biomassa seca. Posteriormente, foi realizada a etapa de sacarificação aumentando a escala de processamento, utilizando um tanque de 1 L com agitação e temperatura controladas. Implementando as mesmas concentrações das enzimas em pH 4,5, temperatura de 45 °C, volume de trabalho de 260 mL e tempo de incubação de 42 h, sob operação em batelada alimentada com alimentação de substrato após 14 h e 22 h, foi obtido um hidrolisado com concentração de 185,7 g.L-1 de açúcares redutores, representando um incremento de 37,6% quando comparado com os resultados obtidos na etapa previa de otimização. De igual forma, o rendimento de glucose foi de 0,38 g/gSBH, o que correspondeu a 60% de conversão de celulose. Com o hidrolisado produzido e com o glicerol residual, o microrganismo Cupriavidus necator DSMz 545, efetuou a fermentação em cultivo tipo batch em escala de bancada (inóculo 10% (v/v), 30°C, 150 rpm, pH 6-7, 96 h) obtendo um acúmulo máximo de 39% de PHB. Assim, comprovou-se pela primeira vez, que a casca de soja e o glicerol residual, são matérias primas plausíveis e de baixo custo para a produção de moléculas de médio a alto valor agregado. Abstract: Current environmental problems urgently require the application of technologies and knowledge to find solutions that enable the continuity of production processes in a sustainable way. Biorefineries based on the soybean (Glycine max) production chain have been studied and show good perspectives for the generation of middle to high-value-added biomolecules. In this context, the present project aimed to use agro-industrial residues present in large quantities in Brazilian territory, in this case, soybean hulls and residual glycerol, for the biotechnological production of biopolymers, specifically polyhydroxyalkanoates (PHA). This work is part of the BRICS-BEST CNPq/MCTIC/BRICS-STI project No. 18/2016 proposal 271.The first part of this work focuses on the review and analysis of technologies, advances, and challenges related to the production of microbial PHA from lignocellulosic biomass hydrolysates. The second part of this study describes the implementation of soybean hulls and residual glycerol as carbon sources for PHA production. Thus, to explore the alternative of valuing agro-industrial residues from Brazilian territory present in large quantities, to produce PHA, the stages of structural characterization of the soybean hull were developed to then define, according to the composition found (cellulose 31.0 ± 1.6%; hemicellulose 11.8 ± 1.3%; lignin 6.18 ± 0.8%; proteins 10.5%, extractives 9.3 ± 1.0%; ash 3.6 ± 0. 03%; humidity 6.0 ± 0.10%; other 21.62%), the best treatment to follow for the recovery of sugars present in the lignocellulosic material. The bioconversion of lignocellulosic biomass into biopolymers involves three major upstream unit operations: material pretreatment, saccharification, and fermentation. Thus, for the first step, an alkaline pre-treatment [NaOH 2% (w/v)] of the substrate [10% (w/v)] was defined under mild conditions (60 min - 121°C - 1 atm.). For the saccharification process, a non-commercial enzymatic cocktail was implemented, composed of cellulase (B1), xylanase (B1-XylA), and B-glucosidase (F10) complexes. For the enzymatic saccharification optimization was implemented the Response Surface Methodology based on the Central Composite Design tool, where the variables of enzyme concentration, substrate loading, and processing time were analyzed. As a result, in the best optimization condition, a hydrolysate with 115.9 g·L-1 of reducing sugars was obtained, adding 62% (w/v) of pre-treated soybean hulls, with a processing time of 42 h, and with the enzymatic load of 11.5 mg protein/g dry substrate for enzyme preparation B1, 2.88 mg protein/g dry substrate for B1-XylA, and 57.6 U/g dry substrate for F10, after 42 h at 45°C and pH 4.5. Subsequently, the saccharification step increased the processing scale, using a 1L tank with controlled temperature and agitation. Implementing the same enzyme concentrations at pH 4.5, 45 °C, working volume of 260 mL, and incubation time of 42 h, under fed-batch operation with substrate feed after 14h and 22h, was reached a hydrolysate with a concentration of 185.7 g.L-1 reducing sugars, representing an increase of 37.6% when compared to the results obtained in the previous optimization step. As well, glucose yield was 0.38 g/gSBH, which corresponded to 60% cellulose conversion. Using the soybean hydrolysate and waste glycerol, the microorganism Cupriavidus necator DSMz 545 carried out the fermentation in batch culture (inoculum 10% (v/v), 30°C, 150 rpm, pH 6-7, 96 h) obtaining a maximum accumulation of 39% of PHA. Thus, it was proved for the first time that soybean hulls and residual glycerol are plausible and low-cost raw materials to produce molecules of medium to high-added value.
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