Clonagem, expressão recombinante e atividade de enzimas de insetos-praga, visando à degradação de biomassa vegetal

Abstract

Resumo: O sequenciamento dos transcriptomas dos insetos-praga Anthonomus grandis (bicudo-do-algodoeiro) e Telchin licus licus (broca-gigante da cana-de-açúcar) possibilitou a identificação e caracterização de novas moléculas potencialmente envolvidas na degradação de biomassa vegetal. Após analisar os contigs destes transcriptomas, foram selecionadas para expressão heteróloga moléculas com similaridade de sequências de aminoácidos para enzimas envolvidas na degradação de biomassa vegetal. As moléculas selecionadas foram: (1) uma endo-beta-1,4- glucanase [(EGase), EC 3.2.1.4], da família glicosil-hidrolase 45 (GHF45), proveniente do A. grandis, a qual denominou-se AgraGH45-1; (2) uma Aldo-ceto Redutase da família 1 (AKR1), proveniente da T. licus licus, denominada TlicAKR-1; e (3,4) duas B- frutofuranosidases (sacarase/invertase) também de T. licus licus, que foram denominadas de TlicSuc1 e TlicSuc2. Para validar a função das proteínas codificadas por esses transcritos, foi utilizado um sistema de expressão baseado na levedura Pichia pastoris para a expressão heteróloga das proteínas correspondentes estudadas. A atividade de AgraGH45-1 purificada foi detectada no ensaio de degradação de CMC (Carboximetilcelulose) e HEC (Hidroxietilcelulose), nas condições ideais de pH 5,0 a 50° C. Quando comparado à uma celulase comercial de Aspergillus niger, a enzima AgraGH45-1 foi 30% mais eficiente para degradar o substrato HEC, nas condições testadas. No caso das sacarases, ambas demonstraram que possuem capacidade de converter sacarose e rafinose em glicose e frutose, com medições realizadas a partir do ensaio de redução de açúcares com DNS. Já para TlicAKR-1, foi realizado o ensaio de atividade avaliando-se diferentes substratos disponíveis, dos quais uma atividade significativa foi encontrada utilizando 2-nitrobenzaldeido; não obstante, a enzima conseguiu uma atividade mínima com aldoses (glicose e xilose), utilizando o cofator NADPH. Os dados obtidos com estas enzimas são promissores, e fazem destas enzimas interessantes candidatas para dar continuidade às pesquisas, visando a suas aplicações na produção de etanol 2G.

Abstract: The sequencing of transcriptomes of insect pests Anthonomus grandis (boll weevil) and Telchin licus licus (sugarcane giant borer) allows the identification and characterization of new molecules potentially used in the degradation of plant biomass. After analyzing the transcripts' contigs, molecules with similar amino acid sequences were selected for enzymes used in the degradation of plant biomass. The selected molecules were: (1) an endo-beta-1,4-glucanase [(EGase), EC 3.2.1.4], from the glycosyl hydrolase family 45 (GHF45), from A. grandis, which was named AgraGH45 -1; (2) an Aldo Keto Reductase from family 1 (AKR1), from T. licus licus that was called TlicAKR-1; and (3.4) two B-fructofuranosidases (sucrase / invertase) from T. licus licus as well, which were called TlicSuc1 and TlicSuc2. In order to validate the function of the proteins encoded by these transcripts, an expression system based on the yeast Pichia pastoris was used for the heterologous expression of the studied proteins. The activity of purified AgGH45-1 was detected in the degradation assay with CMC (Carboxymethylcellulose) and HEC (Hydroxyethylcellulose), under ideal conditions of pH 5.0 at 50 ° C. Compared to the commercial cellulase of Aspergillus niger, AgraGH45-1 was 30% more efficient to degrade HEC substrate under tested conditions. In the case of sucrases, both demonstrate the ability to convert sucrose and raffinose into glucose and fructose, with measurements made from the DNS sugar reduction assay. In the case of TlicAKR-1, activity assay was performed evaluating different available substrates, of which a significant activity with 2-nitrobenzaldehyde was found; nevertheless, an enzyme achieved a moderate activity with aldoses (glucose and xylose), using the NADPH cofactor. The data obtained with these enzymes are promising and make these enzymes interesting candidates to continue the research, aimed at its applications in the production of 2G ethanol.