Isolation and identification of endophytic bacteria from mushrooms for application in plant growth promotion

Abstract

Resumo: Este trabalho de pesquisa teve como objetivo isolar novas bactérias endofíticas de cogumelos, selecionar melhores produtores de ácido indol-3-acético (IAA) com outras caracteristicas de promoção de crescimento de plantas, como solubilização de fosfato e atividade de fixação de nitrogênio, e otimizar as condições de produção de IAA, para aplicação na agricultura como promotores de crescimento de plantas. Para atingir esse objetivo, duas cepas bacterianas endofíticas, identificadas pelo sequenciamento parcial do gene 16S rRNA como Providencia sp. e Enterobacter sp., foram escolhidas com base no potencial de produção de IAA na presença de L-triptofano, de setenta e uma (71) bactérias endofíticas isoladas de vários cogumelos silvestres. A natureza endófita destas duas estirpes bacterianas foi confirmada por análise metagenômica do respectivo corpo de frutificação dos cogumelos a partir do qual foram isoladas (Lactarius deliciosus e Boletus edulis). O potencial de produção IAA foi detectado a partir de filtrados de cultura usando o método colorimétrico e confirmado por HPLC. A produção do IAA por esses dois isolados foi otimizada com sucesso usando a combinação de métodos clássicos (Um-Fator-De-Cada-Vez) e estatísticos (Planejamento Fatorial Completo de doisníveis, Planejamento de Plackett-Burman e Metodologia de Superfície de Resposta). A produção de IAA pela cepa Providencia sp. foi afetada apenas pela concentração de L-triptofano, para cada unidade de aumento na concentração de L-triptofano foi observado um aumento de 244,29 unidades de IAA (244,29Mig/mL de IAA). A cepa bacteriana Providencia sp. atingiu o pico de alta produção de IAA de 2880±11 Mig/mL às 15 horas de incubação, o que significa uma produção horária de 192±0,7 Mig/mL.h. Por outro lado, a produção de IAA pela cepa Enterobacter sp. foi significativamente afetado pelas concentrações de amido e L-triptofano. O pico de alta produção de IAA pela cepa Enterobacter sp. foi observado às 168 horas de incubação, com produção horária de IAA de 13,8±0,9 Mig/mL.h (2311,0±155,7 Mig/mL). A suspensão bacteriana de cada cepa (Providencia sp. e Enterobacter sp.) contendo IAA, foi avaliado na cultura da soja em casa de vegetação e observou-se que ambas as suspensões bacterianas contendo IAA promoveram positivamente o crescimento (germinação e crescimento de plantas). Além disso, ambas as cepas bacterianas foram positivas para quase todas as características de promoção de crescimento de plantas testadas (solubilização de fosfato, fixação de N2 atmosférico, produção de HCN, actividade antifúngica contra Aspergillus niger, Fusarium moniliforme and Gibberella sp.).

Abstract: This research work aimed at the isolation of novel endophytic bacteria from mushrooms, the selection of better indol-3-acetic acid (IAA) producers with other plant growth promotion traits such as phosphate solubilization and nitrogen fixation activity, and the optimization of the conditions of IAA production, for application in agriculture as plant growth promoters. To achieve this goal, two endophytic bacterial strains, identified by partial 16S rRNA gene sequencing as Providencia sp. and Enterobacter sp., were chosen based on the production potential of IAA in the presence of L-tryptophan, from seventy-one (71) endophytic bacteria isolated from several wild mushrooms. The endophyte nature of these two bacterial strains was confirmed by metagenomic analysis of the respective mushrooms fruiting body from which they were isolated (Lactarius deliciosus and Boletus edulis). The IAA production potential was detected from culture filtrates using the colorimetric method and confirmed by HPLC. The IAA production by these two isolates has been successfully optimized using the combination of classic (One-Factor-At-Time) and statistical methods (Two-level Full Factorial Design, Plackett-Burman Design and Response Surface Methodology). The production of IAA by the strain Providencia sp. was affected only by the concentration of L-tryptophan, for each unit of increase in the concentration of L-tryptophan generated an increase of 244.29 units of IAA (244.29Mig/mL of IAA). The bacterial strain Providencia sp. reached the peak of high IAA production of 2880±11 Mig/mL at 15 hours of incubation, which means an hourly production of 192±0.7 Mig/mL.h. On the other hand, the production of IAA by the strain Enterobacter sp. was significantly affected by starch and L-tryptophan concentrations. The peak of high IAA production by the strain Enterobacter sp. was observed at 168 hours of incubation, with hourly IAA production of 13.8±0.9 Mig/mL.h (2311.0±155.7 Mig/mL). The bacterial suspension of each strain (Providencia sp. and Enterobacter sp.) containing IAA, was evaluated in the soybean culture in a greenhouse and it was observed that both bacterial suspensions containing IAA positively promoted the growth (germination and plant growth). In addition, both bacterial strains were positive for almost all tested plant growth promotion characteristics (phosphate solubilization, atmospheric N2 fixation, ammonia production, HCN production, antifungal activity against Aspergillus niger, Fusarium moniliforme and Gibberella sp.).