Performance evaluation of selected and recombinant antigens for detection of Leishmaniases by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA)

Abstract

Resumo: Métodos eficazes para o diagnóstico de leishmaniose são urgentemente necessários, seja para prevenção e controle da leishmaniose em áreas endêmicas ou direcionamento do tratamento de pacientes infectados. Este estudo descreve um imunoensaio ligado à enzima (ELISA) utilizado para medir os níveis séricos de anticorpos anti-a-Gal em indivíduos com leishmaniose cutânea (LC) e a avaliação de uma proteína recombinante relacionada com o gene da cinesina de Leishmania braziliensis (Lbk39) para o diagnóstico de leishmaniose. Para isso, duas neoglicoproteínas contendo a fração terminal Gala1-3Gal (Gala1-3Galß1-4GlcNAc-HAS, identificado como NGP 2334, e Gala1-3Gal-HAS, identificado como NGP2203) e o análogo de neoglicoproteína contendo a fração terminal Gala1-3Gal (Gala1-3Galß1-3GlcNAc-HAS, identificado como NGP2333) foram testados. Já o gene sintético Lbk39 de L. braziliensis foi concebido com base no gene relacionado com a cinesina de L. infantum. O gene sintético foi, então, inserido no vetor recombinante pLEXSY-SAT2, com adição de cauda de histidina (6×His-tag) e transfectados para células hospedeiras de L. tarantole. Após a produção e purificação da proteína recombinante, a mesma foi avaliada quanto à sua capacidade de reconhecer anticorpos anti-L. braziliensis e anti-L. infantum. Condições ótimas de ELISA foram estabelecidas para todos os antígenos testados. As médias de títulos de anticorpos anti-a-Gal de pacientes com LC foram significativamente maiores (p<0.05) do que as médias dos indivíduos saudáveis para todos os NGPs testados. Notou-se tambem que todos osantígenos de NGPs foram capazes de ser mais bem detectados por anticorpos anti-a-Gal de pacientes com LC que estavam sob observação pós-tratamento. Nenhum dos antígenos de NGPs foi reconhecido por anticorpos de indivíduos saudáveis, indicando que o dissacarídeo Gala1-3Galß é o sacarídeo imunodominante na superfície de células de Leishmania e é o único com estrutura terminal de glicoesfingolípidos não redutor reconhecidos por anticopos anti-a-Gal. O antígeno Lbk39 foi fracamente reconhecido por pacientes com LC, apesar do alto valor de sensibilidade obtido (88.9%). Tal antígeno tambem demonstrou capacidade de detecção de níveis de anticorpos de pacientes com LV significativamente (p<0.05) mais elevada do que pacientes com LC, com alta sensibilidade (80%) e especificidade (95.5%). Apenas reações cruzadas com soro de pacientes com doença de Chagas foram observadas para todos os antíegnos testados. Pode concluir-se que as glicoproteínas provaram ser uma ferramenta muito mais confiável para o diagnóstico serológico de LC, apesar dos altos valores de sensibilidade e especificidade obtidos para o antígeno recombinante Lbk39 para pacientes com LC e LV.

Abstract:

Abstract : Rapid methods for effective leishmaniases diagnosis and species identification are urgently needed, either by the prevention and control of leishmaniases in endemic areas or the treatment of infected patients. This study describes an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) used to measure serum levels of anti-a-Gal antibodies in individuals with cutaneous leishmaniasis (CL) and the evaluation of the Leishmania braziliensis kinesin-related recombinant protein (Lbk39) for the diagnostic of leishmaniases. For that, two neoglycoproteins (NGP) containing the Gala1-3Gal terminal fraction (Gala1-3Galß1-4GlcNAc-HAS, identified as NGP 2334; and Gala1-3Gal-HAS, identified as NGP2203) and one Gala1-3Gal NGP analogue (Gala1-3Galß1-3GlcNAc-HAS, identified as NGP2333) were tested. In addition, the synthetic Lbk39 gene was designed based on the kinesin-related gene of L. infantum and the homology search was performed by BLAST similarity in tritrypDB database website. The Lbk39 gene was inserted into pLEXSY-sat2 recombinant vector, cloned with 6×His-tag and transfected into L. tarantole host cells. Optimal ELISA conditions were established for all antigen tested. Means of anti-a-Gal antibody titres of CL patients were significantly (p<0.05) higher compared to the healthy individuals for all of NGPs tested and could be detected at the same level when crude extract from L. braziliensis as antigen was used. It can also be noticed that all NGPs were able to be better detected by anti-a-Gal antibodies from CL patients that had just finished the anti-Leishmania treatment. None of the NGPs was significantly (p<0.05) recognized by the healthy individuals, indicating that the disaccharide Gala1-3Galß is the immunodominant saccharide in Leishmania cell surface and is the unique non-reducing terminal glycosphingolipids structure recognized by anti-a-Gal. The Lbk39 recombinant antigen was weakly recognized by CL patient’s antibodies, despite its high sensitivity value (88.9%). The antigen also demonstrated significantly (p<0.05) higher antibody detection levels for VL patients, with high sensitivity (80%) and specificity (95.5%). Cross-reaction only with the Chagas Disease patients was observed for all antigens tested. It can be concluded that glycoproteins have proven to be a much more reliable tool to the serological diagnosis of CL, despite of the high values of sensitivity of the Lbk39 recombinant antigen for both CL and VL.