Advances in mycotechnology : bioprospection of native macrofungi strains, molecular identification and cryopreservation of mycelia, production of antioxidant enzymes, bioprocessing of organic residues and bioprocesses automation and control using free hardware and software
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Data
2018Autor
Vítola, Francisco Menino Destéfanis
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Resumo: A presente tese de doutorado abrange múltiplas contribuições para o desenvolvimento da micotecnologia. Aproximadamente 70 tentativas de isolamento foram realizadas e pelo menos 15 cepas estáveis foram obtidas. Quatro destas culturas foram identificadas com base no sequenciamento de regiões ITS. Foram desenvolvidos novos métodos para criopreservação de micélios, utilizando vermiculite como suporte. Pelo menos 12 cepas foram reativadas após 12 meses de armazenamento, usando estas técnicas. Duas destas cepas foram avaliadas e mantiveram inalteradas a taxa de crescimento radial (0.58±0.38 cm/ dia) e o rendimento de exopolissacarídeos (250±110 mg/ L). Alguns fatores foram avaliados no cultivo de espécies do gênero Pleurotus, utilizando resíduos de pupunha como substrato. A fração externa do resíduo se mostrou excessivamente ácida (pH 3,21±0,15) para o crescimento micelial. P. ostreatus (1,38±0,16 cm/dia) e P. djamor (1,38±0,1 cm/dia) se adaptaram bem à fração interna do substrato. Taxas de inoculação altas (40%) e maior número de furos (4) produziram aumentos significativos (50%) na concentração protéica dos carpóforos. O processamento de resíduos de pupunha por cultivo micelial melhorou a qualidade deste material como fertilizante para o cultivo de alfaces (até 40% de aumento na produtividade). A cinética de produção das enzimas SOD (superóxido dismutase) e CAT (catalase) foi determinada para o cultivo submerso de P. ostreatus (PO). Seis substâncias foram testadas como indutores destas duas enzimas. Sulfonato de lignina 10 g/L resultou em um aumento na atividade de SOD de 700%. A atividade de CAT aumentou em 46% com a adição de H2O2 90mM. Duas cepas de P. ostreatus (PO e PL24) e três de outras espécies: P. djamor (PD), P. eryngii (PE) e P. pulmonarius (PP) foram comparadas quanto à produção de SOD e CAT em cultivo submerso. PD e PO apresentaram mais que o dobro da atividade de SOD das outras cepas testadas. As atividades de CAT de PE, PL24 e PP foram aproximadamente 59% mais altas que as de PO. PD apresentou atividade de CAT praticamente nula. As mesmas três isoformas de SOD foram encontradas em todas as cepas avaliadas. Técnicas para a recuperação do sulfonato de lignina foram desenvolvidas para purificação parcial de SOD para as análises zimográficas. Este objetivo foi alcançado, mantendo aproximadamente 33% da atividade enzimática inicial. Finalmente, foram desenvolvidos aparatos para cultivo micelial submerso. Hardware e software livres foram utilizados para construir protótipos de biorreatores com sistemas de automação e controle. Um controlador de fotoperíodo, um dispositivo termostático e um sistema de inferência da concentração de biomassa on-line, baseado na absorção de laser, foram projetados, programados e construídos. Espera-se que os avanços propostos contribuam para o desenvolvimento de novos processos, permitindo a obtenção de produtos que tragam benefícios à saúde e à qualidade de vida da população. Abstract: The present doctorate thesis covers multiple contributions for the development of mycotechnology. Approximately 70 isolation trials were performed and at least 15 stable strains were obtained. Four of these cultures were identified based in ITS regions sequencing. New methods for mycelia cryopreservation were developed, with the use of vermiculite as a carrier material. At least 12 strains were reactivated after twelve months of storage, using these techniques. Two of these strains were evaluated and kept metabolic characteristics unaltered, such as radial growth rate (0.58±0.38 cm/ day) and exopolysaccharide yield (250±110 mg/ L). Several factors were evaluated in the cultivation of some species of the Pleurotus genus, using pejibaye palm sheath residues as substrate. The external fraction of the residue proved excessively acid (pH 3,21±0,15) for mycelial growth. P. ostreatus (1,38±0,16 cm/day) and P. djamor (1,38±0,1 cm/day) adapted well to the internal fraction of the substrate. High levels of both inoculum rate (40%) and number of holes (4) produced significative increases in the protein content (50% increase) of the carpophores. The processing of pejibaye residues by mushrooms cultivation, improved its quality as fertilizer for lettuce cultivation (up to 40% increase in lettuce yield). The production kinetics of the antioxidant enzymes SOD (superoxide dismutase) and CAT (catalase) by the submerged mycelial cultivation of P. ostreatus (PO strain) were determined. Six substances were evaluated as inducers of these two enzymes. Lignin sulfonate was the best SOD inducer and hydrogen peroxide was the best CAT inducer. Lignin sulfonate 10 g/L increased SOD activity in approximately 700%. H2O2 90 mM increased CAT activity in up to 46%. Two P. ostreatus strains (PO and PL24) and three other species - P. djamor (PD), P. eryngii (PE) and P. pulmonarius (PP) - were compared in respect to SOD and CAT production by submerged cultivation. PD and PO presented more than double the SOD activity than the other assayed strains. PE, PL24 and PP CAT activities were about 59% higher than that of PO. PD showed virtually no measurable CAT activity. The same three isoforms were detected for these five strains. Lignin sulfonate recovering techniques were developed in order to partially purificate SOD sufficiently for zymographic methods. This objective was accomplished, maintaining nearly 33% of the enzymatic activity of the product. Finally, apparatuses for macromycetes mycelia submerged cultivation were developed. Free hardware and software were used for building bioreactors prototypes with automation and control systems. A photoperiod controller, a thermostatic device and an on-line biomass concentration estimation system, based in laser absorption were designed, programmed and built. It is expected that the proposed advances can contribute for new processes development, allowing the obtention of products that are intended to bring health benefits and improvements in populations' life quality.
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