Desenvolvimento de um bioprocesso para a produção, recuperação e formulação de fitase termoestável de Ganoderna sp. MR-56 obtida por cultivo submerso

Abstract

Resumo: A presente tese teve como objetivo a produção de fitase termoestável de Ganoderma sp. MR-56 empregando o extrato de farelo de trigo, um subproduto agroindustrial, como substrato para o cultivo submerso. As fitases são enzimas comumente utilizadas em processamento de ração animal e alimentos para catalisar a degradação do ácido fítico em inositol e fosfatos. O ácido fítico é considerado um fator anti-nutricional presente nos vegetais, pois diminui a biodisponibilidade de alguns nutrientes em aves e suínos. Dessa forma, a aplicação da fitase reduz a adição de fosfato inorgânico nas rações, consequentemente, um benefício econômico e a diminuição da excreção desse mineral no meio ambiente. Atualmente as fitases produzidas industrialmente têm origem microbiana e são obtidas por processos fermentativos. Porém, a produção de fitases de macromicetos ainda é limitada e por cultivos submersos nunca reportados na literatura até o presente estudo. A tese teve como objetivo identificar o micro-organismo produtor de fitase e otimizar a produção da enzima. Além disso, a recuperação, caracterização, formulação e o estudo da estabilidade da enzima também foram realizados. O Ganoderma sp. foi identificado por métodos morfológico e molecular. A otimização da produção de fitase foi constituída por 2 etapas: a primeira consistiu em um delineamento experimental do tipo DCCR (Delineamento Composto Central Rotacional) para estudar a suplementação do meio de cultivo com melaço de soja, extrato de levedura e cloreto de cálcio. A segunda etapa da otimização foi constituída de um DCCR e os fatores estudados foram temperatura de cultivo, pH inicial e taxa de inoculação. O meio de cultivo otimizado continha extrato de levedura 8% m/v, temperatura de 30°C, pH 6,0 e taxa de inoculação de 3% v/v e a produção máxima de fitase foi de 14,5 U mL-1. Nos estudos de cultivo submerso em diferentes tipos de biorreatores, o frasco tipo Dreschel com 2 vvm resultou na melhor produção da enzima de 20,94 U mL-1, porém o STR alcaçou uma melhor produtividade de fitase de 0,14 U-1mL-1h-1. A concentração por ultrafiltração em dispositivos de centrifugação em tubos com poro de 30 kDa apresentou maior concentração da enzima em 36,75 vezes. As estratégias de purificação de cromatografia de troca iônica, filtração em gel S-100 e S-400 não foram eficientes para a separação da fitase. Por outro lado, o zimograma indicou bandas com atividade de fitase as quais apresentaram elevada massa molecular. A fitase foi caracterizada e apresentou pH ótimo entre 4,5 e 5,0, e adequada termoestabilidade à 80 e 90ºC/30 min com 100 e 94,24% de atividade residual, respectivamente. A fitase foi ativada por Mn2+, Ca2+, Na+, Co2+, Fe2+, EDTA e fosfato inorgânico na concentração de 1 mM. Após seriados estudos de formulação líquida com emprego de aditivos, verificou-se que a presença do antimicrobiano A1 0,21% e antioxidante O2 0,0021% foram importantes para a manutenção da estabilidade da enzima durante o armazenamento (103,5% de atividade relativa) em 15 dias em condições aceleradas (40ºC). Os estudos de armazenamento à temperatura ambiente da fitase em pó resultaram que o polímero E2 apresentou 79% de atividade residual após 90 dias de estudo. A fitase produzida e formulada apresentou um potencial para possível aplicação em ração animal e produtos para consumo humano com o intuito de diminuir o fitato, bem como melhorar a absorção de alguns nutrientes.

Abstract: The aim of this thesis was the production of a thermostable phytase from Ganoderma sp. MR-56 by submerged culture, using wheat bran extract as agroindustrial by-product. Phytases are enzymes employed in processing feed and food to catalyze the degradation of phytic acid to inositol and phosphates. The phytic acid is considered an antinutritional factor present in vegetables and decreases the bioavailability of some nutrients in poultry and pigs. The phytase application reduces the inorganic phosphate addition on feed, therefore, an economic benefit and diminished excretion of this mineral into the environment. Currently, phytases from microbial source have been obtained by industrial fermentation processes. However, phytases production by macromycetes is still limited and by submerged culture production had never been reported before in the literature. This thesis aims to identify the microorganism producing phytase and optimize enzyme production by submerged culture. In addition, recovery, characterization, formulation and stability studies of phytase were performed. The Ganoderma sp. was identified by morphological and molecular methods. The optimization of phytase bioprocess was composed by two steps: the first consisted of an experimental design CCRD two levels and three factors to study the submerged culture medium supplementation composed of soybean molasses, yeast extract and calcium chloride. The second optimization consisted of CCRD and the factors studied were culture temperature, initial pH and inoculum rate. The optimized medium contained 8% w/v yeast extract, temperature of 30°C, pH 6.0 and 3% v/v inoculum rate and the maximum phytase production reached 14.5 U mL-1. Studies of different bioreactors for phytase synthesis, the Dreschel bottle type with 2 vvm was the best for enzyme production (20.94 U mL-1), however in STR reached the best phytase productivity of 0,14 U-1mL- 1h-1. The ultrafiltration tubes using 30 kDa fraction retained was 36.75-fold of concentrated enzyme. Strategies purification, of ion exchange chromatography, gel filtration S-100 and S-400 were not effective for the phytase separation. Phytase zymogram suggested activity bands with estimated high molecular weight. The enzyme was characterized and had optimum pH of 5.0 and a thermo stability phytase at 80 to 90ºC for 30 min showed 100 and 94.24% of residual activity, respectively. The enzyme was activated by Mn2+, Ca2+, Na+, Co2+ and Fe2 +, EDTA and inorganic phosphate at concentrations of 1 mM. After series of studies for phytase liquid formulation additives, it was found that the antimicrobial 0.21% A1 and antioxidant 0.0021% O2 were important to maintain enzyme stability during storage 103.5% phytase residual activity on 15 days at 40°C. The formulation powder studies allowed select the polymer E2 for phytase encapsulation with 79% phytase activity relative at room temperature after 90 days of storage. The produced and formulated phytase presented a potential application for feed and processed food in order to reduce the phytate as well as improving some nutrients absorption.