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dc.contributor.advisorStinghen, Andréa Emilia Marquespt_BR
dc.contributor.authorGregório, Paulo Cezarpt_BR
dc.contributor.otherBarreto, Fellype de Carvalhopt_BR
dc.contributor.otherUniversidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básicapt_BR
dc.date.accessioned2017-05-04T20:23:07Z
dc.date.available2017-05-04T20:23:07Z
dc.date.issued2016pt_BR
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/1884/46037
dc.descriptionOrientadora : Profª. Drª. Andréa Emilia Marques Stinghenpt_BR
dc.descriptionCoorientador : Prof. Dr. Fellype de Carvalho Barretopt_BR
dc.descriptionDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 17/02/2016pt_BR
dc.descriptionInclui referências : f. 58-70pt_BR
dc.descriptionÁrea de concentraçãopt_BR
dc.description.abstractResumo: Os produtos de glicação avançada (AGEs) são toxinas urêmicas com vários efeitos deletérios no organismo, envolvidos na disfunção endotelial e doença cardiovascular em pacientes com doença renal crônica (DRC). No presente trabalho, investigou-se in vitro em células endoteliais humanas, a capacidade de ligação dos AGEs ao Sevelamer, como possível estratégia terapêutica. Desta forma utilizou-se o receptor para AGEs (RAGE) e a interleucina-8 (IL-8) como biomarcadores de disfunção endotelial. Os AGEs foram preparados por glicação da albumina e caracterizados por absorbância e eletroforese em gel de poliacrilamida. Os níveis de endotoxinas dos AGEs sintetizados, foram mensurados pelo método de Limulus Amebocyte Lysate (LAL). As amostras apresentam-se livres de endotoxinas. Células endoteliais humanas foram incubadas em meio de cultura contendo AGEs (0,2 mg/mL) com ou sem Sevelamer (3%). O efeito dos AGEs sobre a viabilidade celular foi avaliado pelo ensaio de MTT. Realizou-se o ensaio de ressonância magnética nuclear (RMN), em sobrenadante celular contendo fosfato (Pi), a fim de validar o efeito quelante in vitro do Sevelamer sobre o Pi. Da mesma forma, os níveis de IL-8 foram analisados no sobrenadante por meio do ELISA. A expressão de RAGE foi avaliada por imunocitoquímica e Western blot. A propriedade quimiotática do sobrenadante celular após a exposição aos AGEs com ou sem Sevelamer, foi avaliada em monócitos humanos (Células U-937) usando o ensaio de migração com auxílio da câmara de Boyden. A exposição aos AGEs não afetou a viabilidade celular, mas induziu significativamente a expressão de RAGE quando comparados com as células controle (P<0,005); ainda, a expressão de RAGE diminuiu após tratamento com Sevelamer em relação ao tratamento somente com AGEs (P<0,05). O Sevelamer diminuiu significativamente os níveis de Pi, confirmando sua propriedade in vitro. Os níveis de IL-8 aumentaram significativamente após 6h de tratamento com AGEs quando comparado ao controle (17,14 ± 3,1 vs 8,2 ± 1,0 pg/mL; P<0,005); enquanto um aumento significativo foi observado nos níveis de IL-8 quando comparado as células tratadas somente com AGEs em relação com AGEs mais Sevelamer (17,14 ± 3,1 vs 27,6 ± 2,2 pg/mL; P<0,05). Quando os AGEs foram adicionados no meio de cultura, o sobrenadante de células endoteliais induziu a quimiotaxia de monócitos (402,3 ± 163,8%; P<0,05) , que foi reduzido (402,3 ± 163,8 vs 33,3 ± 7,4%; P<0,05) após o tratamento com Sevelamer. O tratamento com Sevelamer reduziu a expressão de RAGE e migração de monócitos e aumentou a expressão de IL-8, uma interleucina descrita como anti-inflamatória, que hipoteticamente pode levar a diminuição de moléculas de adesão. Nossos resultados sugerem que o Sevelamer é capaz de se ligar a outras toxinas urêmicas além do Pi, tais como os AGEs. Esse efeito pleiotrópico pode contribuir para a proteção do endotélio, entretanto experimentos adicionais são necessários para um melhor entendimento dos mecanismos relacionados à disfunção endotelial mediada por AGEs e o potencial papel protetor do Sevelamer. Palavras-chave: Doença renal crônica, disfunção endotelial, AGEs, Sevelamer, IL-8 e RAGE.pt_BR
dc.description.abstractAbstract: Advanced glycation end products (AGEs) are uremic toxins with several pro-inflammatory effects, which have been implicated in the development of endothelial dysfunction and cardiovascular diseases in patients with chronic kidney disease (CKD). We sought to investigate the in vitro AGEs-binding capacity of Sevelamer, as a potential anti-inflammatory strategy, using human endothelial cells. For this purpose we chose the receptor for AGE (RAGE) and the interleukin-8 (IL-8) as biomarkers of endothelial dysfunction. The AGEs were prepared through the method of albumin glycation and characterized by absorbance and polyacrylamide gel electrophoresis. The AGEs endotoxin levels were measured through the Limulus Amebocyte Lysate (LAL) method. The samples were free of endotoxins. The human endothelial cells were incubated in a culture media containing AGEs (0.2 mg/mL) with or without Sevelamer (3%). The effect of AGEs on cell viability was assessed by MTT assay. A nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the levels of phosphate in samples, was performed in order to verify Sevelamer's phosphate binder function in vitro. In addition, IL-8 levels were analyzed in cell supernatant, through enzyme linked immunosorbent assay. RAGE expression was evaluated through immunocytochemistry and Western blot. The chemotactic property of the endothelial cell supernatant after exposure to AGEs, with or without Sevelamer, was evaluated in human monocytes (U-937 cells) using Boyden chamber migration assay. Although the AGEs exposure did not affect the cell viability, it induced significantly RAGE expression when compared to control cells (P<0.005); moreover RAGE was significantly decreased after the Sevelamer treatment, if compared to the treatment with AGEs (P<0.05). The Sevelamer significantly decreased phosphate levels, therefore confirming its property in vitro. IL-8 levels significantly increased after 6h AGEs treatment when compared to control cells (17.14 ± 3.1 vs 8.2 ± 1.0 pg/mL; P<0.005); while a significant increase was observed in IL-8 levels in cells treated only with AGEs when compared to the treatment of AGEs with Sevelamer (17.14 ± 3.1 vs 27.6 ± 2.2 pg/mL; P<0.05). When AGEs were added to the culture media, the endothelial cell supernatant induced significantly monocytes chemotaxis (402.3 ± 163.8%; P<0.05) which was significantly reduced (402.3 ± 163.8 vs 33.3 ± 7.4%; P<0.05) after the Sevelamer treatment. The Sevelamer reduces RAGE expression and monocytes migration, while increasing IL-8 expression, an interleukin described as anti-inflammatory, which hypothetically could lead to the decrease in adhesion molecules. Our results suggest that the Sevelamer is capable of binding to other uremic toxins besides phosphate, such as the AGEs. This pleiotropic effect may contribute to its role on the endothelium protection. Additional experiments are necessary for a better understanding of the mechanisms related to the AGEs mediated endothelial dysfunction and the Sevelamer potential protective role. Keywords: Chronic kidney disease, endothelial disfuncion, AGEs, Sevelamer, IL-8 e RAGE.pt_BR
dc.format.extent74 f. : il. algumas color., grafs., tabs.pt_BR
dc.format.mimetypeapplication/pdfpt_BR
dc.languagePortuguêspt_BR
dc.relationDisponível também em formato digitalpt_BR
dc.subjectMicrobiologiapt_BR
dc.subjectParasitologiapt_BR
dc.subjectDoença renalpt_BR
dc.subjectSevelamerpt_BR
dc.titleAnálise in vitro do efeito do sevelamer na disfunção endotelial causada por produtos de glicação avançada (AGEs)pt_BR
dc.typeDissertaçãopt_BR


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