The potential use of fructophilic acid lactic bacteria to improve cocoa beans fermentation : isolation, selection and evaluation

Abstract

Resumo: No processamento pós-colheita de cacau, a fermentação é uma etapa essencialna formação de cor, sabor e aroma das amêndoas. Durante este processo, microrganismospresentes no ambiente consomem os açúcares da polpa de cacau, facilitando o processode secagem das sementes. Devido à natureza glucofílica dos microrganismos, a glicose éconsumida rapidamente e altos níveis de frutose residual são geralmente observados. Issoacarreta um processo de secagem ineficiente, além de servir como açúcar residual para ocrescimento de microrganismos indesejáveis. As bactérias ácido-láticas frutofílicas sãometabolicamente caracterizadas por preferirem frutose à glicose como fonte de carbono.Neste contexto, este trabalho teve como objetivo isolar, selecionar e avaliar o potencialde bactérias ácido-láticas frutofílicas para otimizar o consumo de açúcares e formação demetabólitos durante a etapa de fermentação de cacau. Na primeira etapa do estudo,fermentações de cacau em escala laboratorial foram avaliadas quanto à presença ediversidade de bactérias ácido-láticas por sequenciamento de nova geração (IlluminaMiSeq), indicando a presença de potenciais bactérias frutofílicas pertencentes aos gênerosFructobacillus e Lactobacillus. Um total de 80 cepas microbianas com rápido consumode frutose foram isoladas e identificadas por métodos moleculares. Dez cepasidentificadas como Lactobacillus plantarum foram caracterizadas como "bactériasfrutofílicas facultativas" a partir do perfil de consumo de diferentes açúcares.Lactobacillus plantarum LPBF35 foi finalmente selecionada por produzir moléculasaromáticas, tais como acetato de etila e nonanal. A confirmação da classificação de L.plantarum LPBF35 como bactéria frutofílica facultativa ocorreu com base na avaliaçãodo sequenciamento de seu genoma, indicando a presença dos genes adhE1 e adhE2responsáveis pela expressão da enzima álcool/acetaldeído desidrogenase. A introduçãode L. plantarum LPBF35 como cultura iniciadora otimizou significativamente o consumode frutose da polpa durante a fermentação de cacau quando comparada aos processosutilizando uma cepa glucofílica (Pediococcus acidilactici LPBF66) e à fermentaçãoespontânea (sem inoculação). Na segunda etapa, o metabolismo de L. plantarum LPBF35foi estudado em cultura mista com Ped. acidilactici LPBF66 ou Pichia fermentansYC5.2. L. plantarum LPBF35 dominou todas as co-inoculações avaliadas e, quandoinoculada em cultura mista com a levedura P. fermentans YC5.2, aumentou a eficiênciado consumo de açúcares da polpa e a formação de compostos aromáticos durante afermentação (2-metil-1-butanol, acetato de isoamila e acetato de etila) e das amêndoasapós a secagem (acetato de etila, 2,3-butanodiol, benzaldeído e 2,3-butanodiona). Estesresultados demonstram que o consórcio microbiano entre bactérias frutofílicas e leveduraé ideal para melhorar o metabolismo de açúcares e a formação de metabólitos durante afermentação de cacau.

Abstract: Fermentation is an essential step in the cocoa-processing for color, flavor, andaroma development. During this process, microorganisms in the environment consumesugars present in the cocoa pulp, favoring the drying of the beans. Due to the glucophiliccharacter of microorganisms, glucose is consumed quickly, and high levels of residualfructose are often observed. It results in an inefficient drying process besides being aresidual sugar for the growth of undesirable microorganisms. Fructophilic lactic acidbacteria are metabolically characterized by preferring fructose over glucose as a carbonsource. In this context, this study aimed to isolate, select, and evaluate the potential offructophilic lactic acid bacteria to optimize the sugar consumption and metabolitesformation during cocoa fermentation. In the first stage of this study, laboratory cocoabeans fermentation was evaluated for the presence and diversity of lactic acid bacteria bynew generation sequencing (Illumina MiSeq), indicating the presence of potentialfructophilic bacteria of the genera Fructobacillus and Lactobacillus. A total of 80microbial strains with fast fructose consumption were isolated and identified bymolecular methods. Ten strains identified as Lactobacillus plantarum were characterizedas facultative fructophilic bacteria due to the consumption profile of different sugars.Lactobacillus plantarum LPBF35 was finally selected due to its ability to producearomatic molecules, such as ethyl acetate and nonanal. The classification of L. plantarumLPBF35 was confirmed as facultative fructophilic bacteria based on the evaluation of thesequencing of its genome, indicating the presence of the adhE1 and adhE2 genes thatexpress the alcohol/acetaldehyde dehydrogenase enzyme. The introduction of L.plantarum LPBF35 as a starter culture significantly optimized the fructose consumptionof the pulp during cocoa fermentation when compared to the process using a glucophilicstrain (Pediococcus acidilactici LPBF66) and the spontaneous fermentation (noninoculation).In the second stage of this study, the metabolism of L. plantarum LPBF35was studied in a mixed culture with Ped. acidilactici LPBF66 or Pichia fermentansYC5.2. L. plantarum LPBF35 dominated all evaluated co-inoculations and, wheninoculated in a mixed culture with the yeast P. fermentans YC5.2, it increased theefficiency of the consumption of pulp sugars and formation of aromatic compoundsduring fermentation (2-methyl-1-butanol, isoamyl acetate, and ethyl acetate) and in thebeans after drying (ethyl acetate, 2,3-butanediol, benzaldehyde, and 2,3-butanedione).The results of this study suggest that FLAB and yeast is a microbial consortium that canimprove sugar metabolism and aroma formation during cocoa beans fermentation.