Development of a rapid and cost-effective samplepreparation protocol for dna extraction from Mycobacterium tuberculosis with application to point of care testing

Abstract

Resumo: Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), "a tuberculose (TB) é a nona principal causa de morte no mundo e a principal causa de um único agente infeccioso, acima do HIV / AIDS". As metas estabelecidas pela estratégia End TB incluem redução de 80% na incidência de TB e redução de 90% na mortalidade associada à TB entre 2015 a 2030. O diagnóstico do ponto de atendimento é um dos aspectos que podem ter o potencial para ajudar nessa epidemia mundial. O preparo rápido da amostra e a racionalização da extração de DNA é um dos desafios para o diagnóstico molecular atualmente disponível para detecção de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), que impede seu uso em áreas com recursos limitados. Este trabalho apresenta um protocolo prova de conceito para liquefação e desinfecção de escarro, seguido de um procedimento para extração de DNA baseado em papel, que foi subsequentemente usado em um equipamento de PCR Tempo Real portátil (o sistema Q3-Plus) para amplificar e detectar alvos genômicos específicos de Mtb. Diversos compostos químicos e diferentes matrizes foram testadas para substituir os componentes dos protocolos comerciais tradicionais usados para tratamento, estocagem e extração de DNA. O protocolo completo otimizado (liquefação da amostra, extração de DNA, e determinação usando PCR portátil) foi testado com 17 amostras de pacientes. Os resultados foram comparados com os obtidos com um termociclador padrão (ABI7500), assim como com o GeneXpert e a cultura, que são considerados os métodos padrão-ouro tradicional e molecular. Foi observado que o protocolo desenvolvido nesta tese mostrou concordância para a maioria das amostras, como com o GeneXpert e a cultura. Embora o número de amostras usado foi baixo, o alto grau de concordância entre os protocolos e plataformas certamente dá suporte a estudos futuros com coortes maiores. Mais importante, o tempo total desde a coleta da amostra até o resultado final do PCR foi de menos de 3 horas, que é muito mais rápido que a cultura e aproximadamente o mesmo tempo do GeneXpert. Entretanto, o custo total por amostra é muito menor com nosso método, o que é sempre o objetivo dos agentes que desenvolvem políticas públicas. Em resumo, o método para preparação de amostra apresentado aqui traz um procedimento rápido e simples, com um número baixo de passos assim como baixo uso de reagentes e equipamentos, resultando num sistema fácil de usar que é apropriado para ambientes POC

Abstract: According to the World Health Organization (WHO), "Tuberculosis (TB) is the ninth leading cause of death worldwide and the leading cause from a single infectious agent, ranking above HIV/AIDS". The targets set by the End TB strategy include 80% reduction in TB incidence and 90% reduction in TB associated mortality between 2015 to 2030. Point of care diagnosis is one of the aspects that might have the potential to help this worldwide epidemic. Smooth sample preparation and streamlining DNA extraction is one of the challenges for the currently available molecular diagnosis of Mycobacterium tuberculosis (Mtb), which hinders their use in resource-constrained areas. This work presents a proof of concept protocol for sputum liquification and disinfection followed by a paper-based DNA extraction procedure, which was used by a portable real time PCR instrument (the Q3-Plus system) to amplify and detect specific Mtb genomic targets. Several chemicals (SDS, NP-40, Urea, Triton X-100 and Guanidine Thiocyanate) and matrices (3M paper and disposable pipette extraction) were tested to substitute the components of traditional commercial protocols used for sample treatment, storage, and DNA extraction. The optimized full method (sample liquification, DNA extraction, and portable PCR determination) was tested with 17 patient samples. Results were compared to those obtained with a standard thermocycler (ABI7500), as well as with GeneXpert and culture, which are considered as molecular and traditional gold standard methods. It was found that the protocol developed in this thesis showed an agreement for the majority of the samples as with the GeneXpert and culture. Although the sample number was low, the high agreement between the protocols and platforms certainly warrants further studies with a higher cohort. More importantly, total time from sample collection to final PCR result was less than 3 hours, which is much faster than culture and at a similar rate as GeneXpert. Moreover, the overall cost per sample extraction is smaller (5 R$) than Roche's kit (20 R$), which is always a goal for public health policy makers. In summary, the sample preparation method described here provides a rapid and easy procedure with a reduced number of steps, as well as minimal use of reagents and equipments, which results in an easy-to-use system suitable for POC settings