Production of the HIV-1 entry inhibitor griffithsin in nicotiana benthamiana and moss systems

Abstract

Resumo: O uso de sistemas de plantas como fábricas para a produção de proteínas recombinantes tornou-se uma alternativa proeminente para as indústrias farmacêuticas, devido ao seu alto potencial de acumulação de proteínas. Nas últimas décadas, a aplicação de plantas para produção de proteínas tem ganhado mais atenção, pois as plantas representam uma estratégia econômica que leva a altos níveis de proteínas purificadas e ativas para o setor farmacêutico. Atualmente, a aprovação pela Food and Drug Administration (FDA) da primeira geração de proteínas recombinantes produzidas em células de cenoura, a taliglucerase alfa, demonstrou que as células vegetais têm uma capacidade significativa para expressar proteínas complexas para uso terapêutico. A exploração de organismos hospedeiros emergentes para a produção econômica e eficiente de antivirais protéicos contra o vírus da imunodeficiência humana (HIV) é necessária em áreas em situação precária em todo o mundo. Esta objetivou a produção da grifitisina (GRFT), como uma proteína neutralizadora do HIV em Nicotiana benthamiana, utilizando três supressores (i.e. silenciadores de genes) e em Physcomitrella patens transgênica. Neste estudo, a produção do novo candidato à inibidor da entrada do HIV nas células, proteína GRFT, foi estudada, utilizando N. benthamiana como plataforma de expressão, baseada em um vetor não-viral. Para aumentar os níveis de GRFT recombinante, o mecanismo de defesa aplicado ao sistema de RNA de interferência (i.e. silenciamento gênico) de N. benthamiana foi abolido usando três supressores virais. Utilizou-se um sistema de expressão transiente transferindo o gene GRFT, que codifica 122 aminoácidos, sob o controle do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) modificado. A presença da GRFT (corretamente enovelada) nas folhas transgênicas foi confirmada, utilizando o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Os dados demonstraram que o uso dos três supressores permitiu o maior acúmulo de GRFT, com um rendimento de 400 ?g g-1 de peso fresco, e essa quantidade foi reduzida para 287 ?g g-1 após a purificação, representando uma recuperação de 71,75%. As análises também demonstrouam que a capacidade de GRFT expressa em N. benthamiana pode se ligar à glicoproteína 120 do HVI, sendo muito semelhante ao da proteína GRFT, purificada a partir de Escherichia coli. Ensaios de células inteiras usando GRFT purificada mostraram que a proteina GRFT purificada foi ativa contra o HIV. Este estudo demonstra a primeira produção em alto nível do inibidor de entrada do HIV-1 (GRFT) em um sistema de expressão não-viral e ilustra a robustez do sistema de expressão de agroinfiltração melhorada, por meio do uso de três supressores silenciadores de genes. A produção de GRFT foi também estudada no sistema de musgo transgênico, o P. patens. A proteina GRFT foi também expressa nesse sistema, mas diferentemente do sistema de expressão transiente, o rendimento da proteína expressa foi baixo.

Abstract: The use of plant systems as factories for recombinant protein production became a prominent alternative for pharmaceutical industries due to their high potential for protein accumulation. In the last decades, the application of plants for protein production has gained more attention, as plants represent an economic strategy that leads to high levels of purified and active proteins for the pharmaceutical sector. Currently, FDA approval of the first generation of recombinant proteins produced in carrot cells, taliglucerase alfa, demonstrated that plant cells have a significant capacity to express complex proteins for therapeutic use. The exploration of emerging host organisms for the economic and efficient production of protein microbicides against HIV is urgently needed in resource-poor areas worldwide. This thesis focuses on the production of griffithsin (GRFT) as an HIV neutralizing protein in Nicotiana benthamiana using three gene silencing suppressors and also in transgenic Physicomiterella patens. In this study, the production of the novel HIV entry inhibitor candidate, GRFT, was investigated using N. benthamiana as the expression platform based on a non-viral vector. To increase the yield of recombinant GRFT, the RNA silencing defence mechanism of N. benthamiana was abolished by using three viral suppressors. A transient expression system was used by transferring the GRFT gene, which encodes 122 amino acids, under the control of the enhanced CaMV 35S promoter. The presence of correctly assembled GRFT in transgenic leaves was confirmed using immunoglobulin-specific sandwich ELISA. The data demonstrated that the use of three gene silencing suppressors allowed the highest accumulation of GRFT, with a yield of 400 ?g g-1 fresh weight, and this amount was reduced to 287 ?g g-1 after purification, representing a recovery of 71.75%. The analysis also showed that the ability of GRFT expressed in N. benthamiana to bind to glycoprotein 120 is close to that of the GRFT protein purified from E. coli. Whole-cell assays using purified GRFT showed that our purified GRFT was potently active against HIV. This study provides the first high-level production of the HIV-1 entry inhibitor GRFT with a non-viral expression system and illustrates the robustness of the co-agroinfiltration expression system improved through the use of three gene silencing suppressors. The production of GRFT was also investigated in transgenic moss P. patens. The GRFT was successfully expressed in transgenic moss but unlike transient expression system, the yield of expressed protein was low.