Avaliação da participação de macrófagos no desenvolvimento da fibrose e da regeneração em modelo de crionjúria cardíaca em Zebrafish

Abstract

Resumo: O infarto agudo do miocárdio (IAM), acompanhado de outras doenças cardíacas, é a principal causa de morte no mundo atualmente. O infarto é causado pela isquemia do miocárdio, o que desencadeia a necrose local. Após a lesão, é essencial que ocorra o reparo, que nos mamíferos culmina com a formação da fibrose. Embora o reparo pós infarto nestes organismos seja bem conhecido, a função dos macrófagos nos diferentes momentos deste processo ainda não é bem elucidada, principalmente em momentos tardios. Portanto, para resolver esta lacuna, este trabalho se dedicou a padronizar adaptação do modelo de crioinjúria cardíaca no zebrafish (Danio rerio) e também a caracterizar macrófagos tardios presentes no reparo da lesão. A crioinjúria cardíaca é uma lesão que ocorre por baixas temperaturas e simula o IAM em zebrafish por causar necrose semelhante à que ocorre em mamíferos. O zebrafish, por sua vez, é capaz de regenerar o coração, e, portanto estudar os macrófagos neste contexto poderá auxiliar no desenvolvimento de terapias mais específicas. Para a caracterização do modelo, foram realizadas leituras de eletrocardiograma (ECG) em animais em 3 dias pós injúria (dpi) e em animais sham, cortes histológicos e também foi realizada a técnica matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) imaging com objetivo de caracterizar o perfil de lipídios no local da lesão. Para identificar a migração das populações de macrófagos, análises de citometria de fluxo foram realizadas. Análises de lipidômica de macrófagos foram adquiridas para identificar o perfil lipídico destas células, em diferentes tempos após a lesão e com o mesmo objetivo, obtivemos cDNA de célula única de macrófagos obtidos de animais em 7 e 21 dpi, material este que será sequenciado em experimentos de single cell mRNA sequencing (scRNAseq) e trará dados do perfil transcriocional destas células, principalmente aquelas presentes em momentos tardios. Por fim realizamos a padronização da confecção de lipossomas encapsulados com ácido zoledrônico, como forma de depletar os macrófagos e assim entender melhor sua função. Portanto, nosso trabalho auxilia em uma maior compreensão dos perfis dos macrófagos durante o processo de regeneração cardíaca de zebrafish após crioinjúria e também no entendimento da função elétrica cardíaca deste animal neste contexto. Como resultados, conseguimos obter leituras claras do ECG, mas não encontramos diferenças no tempo pós lesão analisado, observamos infiltrado inflamatório e deposição de colágeno nos cortes histológicos, mas não obtivemos análises significativas dos dados do experimento utilizando a técnica MALDI imaging. As análises de citometria demonstraram que em tempos tardios de reparo da lesão não há diferença entre a quantidade dos perfis de macrófagos e com a lipidômica foi possível encontrar algumas diferenças de lipídios nos macrófagos entre os tempos após a lesão analisados.

Abstract: Acute myocardial infarction (AMI), accompanied by other heart diseases, is the leading cause of death in the world today. Infarction is caused by myocardial ischemia, which triggers local necrosis. After an injury, the repair is essential, which in mammals culminates in the formation of fibrosis. Although post-infarction repair in these organisms is well known, the function of macrophages at different times in this process is still not well understood, especially at late times. Therefore, to solve this gap, this work was dedicated to standardizing the adaptation of the cardiac cryoinjury model in zebrafish (Danio rerio) and also to characterizing late macrophages present in the lesion repair. Cardiac cryoinjury is an injury that occurs due to low temperatures and simulates AMI in zebrafish by causing necrosis similar to that which occurs in mammals. Zebrafish, in turn, is capable of regenerating the heart, and therefore studying macrophages in this context may help in the development of more specific therapies. For the characterization of the model, electrocardiogram (ECG) readings were performed in animals at 3 days post-injury (dpi), and in sham animals, histological sections and the matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) imaging technique was also performed to characterize the lipid profile at the site of injury. To identify the migration of macrophage populations, flow cytometry analyzes were performed. Macrophage lipidomics analyses were acquired to identify the lipid profile of these cells, at different times after injury, and with the same objective, we obtained cDNA from single-cell macrophages obtained from animals at 7 and 21 dpi, material that will be sequenced in experiments of single-cell mRNA sequencing (scRNAseq) and will bring data on the transcriptional profile of these cells, mainly those present at later times. Finally, we standardized the manufacture of encapsulated liposomes with zoledronic acid, as a way to deplete macrophages and thus better understand their function. Therefore, our work helps in a better understanding of the profiles of macrophages during the cardiac regeneration process of zebrafish after cryoinjury and also in the understanding of the cardiac electrical function of this animal in this context. As a result, we were able to obtain clear ECG readings, but we did not find differences in the time after the injury was analyzed, we observed inflammatory infiltrate and collagen deposition in the histological sections, but we did not obtain significant analyzes of the experimental data using the MALDI imaging technique. Cytometry analyses showed that at late times of injury repair, there is no difference between the number of macrophage profiles, and with lipidomics it was possible to find some differences in lipids in macrophages between the analyzed times after injury.