Bioprocesso para o aumento da produção, recuperação e purificação de a-amilase produzida por Coprinus comatus em resíduo da indústria de trigo

Abstract

Resumo: As amilases são enzimas amplamente usadas nas indústrias de alimentos e estima-se que em 2027 o mercado de enzimas movimente para esta aplicação mais de US$ 2,39 bilhões. Isto torna necessário o desenvolvimento de novas fontes de amilases com melhor desempenho catalítico, sendo produzidas a baixos custos para competir com as enzimas já existentes. Por isto, este projeto visa a produção de uma amilase por macromiceto de forma menos onerosa, com destinação das frações obtidas no cultivo sem geração de resíduos no processo. Primeiramente foram avaliados diferentes processos em batelada utilizando subproduto denominado farinha de fundo de moinho (FFM) em concentrações de 105 g·L-1 e 48,5 g·L-1 e meios sintéticos (controles) baseados nestes, visando avaliar o melhor processo para a produção enzimática. Após, foram realizados estudos com modelos matemáticos para predizer a síntese de enzimas, a produção de biomassa e o consumo de substrato. O ensaio com menor concentração de subproduto foi selecionado como melhor alternativa (48,5 g·L-1 de FFM), diminuindo o custo com o substrato e os resíduos gerados pós-cultivo. Os modelos matemáticos avaliados conseguiram predizer os parâmetros do crescimento da biomassa e do consumo de substrato, entretanto, para a produção enzimática apenas o pico de atividade de alfa-amilase foi predito. Posteriormente, foi realizado o estudo da purificação de baixa resolução que permitiu obter uma enzima com potencial para aplicação industrial. Os processos de precipitação e separação por membranas foram aplicados para a purificação das amilases. A alfa-amilase purificada foi caracterizada quanto a pH (5,0) e temperatura ideal (50 °C) de reação enzimática e massa molecular estimada (=~ 67 kDa). A enzima hidrolisou 99% de um meio contendo 30 g·L-1 de amido em 3h. A liofilização desta enzima permitiu concentrá-la em 18,88 vezes. Entretanto, ainda buscando a diminuição nos custos e a redução de processos e resíduos, foi avaliado a utilização do extrato bruto enzimático (EEB) sem a etapa de purificação. A avaliação do EEB foi realizada avaliando a atividade enzimática, caracterizando a enzima, a toxicidade do extrato e a presença de compostos antioxidantes. A enzima demonstrou estabilidade de armazenamento sem a adição de conservantes, com uma atividade relativa final superior a 60% após 721 dias. O EEB não foi tóxico frente a Artemia salina e apresentou atividade antioxidante. O EEB apresentou pH ideal de 6,0, temperatura 50°C e também teve um aumento da estabilidade térmica na presença de cálcio 2,5 mM. Bem como, hidrolisou 96% do amido e apresentou um aumento da atividade enzimática de 63 vezes com a liofilização. A biomassa que seria um resíduo neste processo foi utilizada para a produção de um pó proteico rico não apenas em proteína (>ou= 26%), mas também em antioxidantes e não apresentaram toxicidade. Este estudo demonstrou o potencial que a cepa do Coprinus comatus tem para a síntese não apenas de a-amilase como também para a produção de outros compostos importantes e também a produção de subprodutos com alto valor agregado como o pó proteico.

Abstract: Amylases are enzymes widely used in the food industry it is estimated that in 2027 this market will represent more than 2.39 billion dollars. Therefore, it is necessary to develop new fonts of amylases with better catalytic performance. These amylases must have a lower production cost to compete with the ones that already exist. Therefore, this project aims to develop an amylase of macromycetes with low production cost and without generating waste in the destination process of the fractions obtained through cultivation. First, different batch processes were evaluated using a by-product named Low-Grade Flour (LGF) with 105 g·L-1 and 48.5 g·L-1 concentrations, and synthetic means of control based on these were performed to assess the best process for the enzyme production. Then, the informed parameters were used in mathematical models to predict enzymatic synthesis, biomass production, and substrate consumption. The trial with a lower concentration of flour was selected as the best alternative (48.5 g·L-1 of LGF) to reduce the substrate cost and the waste generated under submerged post-cultivation. The mathematical models were able to predict biomass growth parameters and substrate consumption. On the other side, considering the enzymatic production, only the alfa-amylase activity peak was predicted. Subsequently, it was carried out a low-resolution study of the purification trial was done to obtain an enzyme with industrial application potential. Precipitation and separation processes by membrane were used for purification. The purified alfa-amylase was characterized based on pH (5.0), the temperature of the ideal enzymatic reaction (50 °C), and the molecular mass (=~ 67 kDa). The enzyme was able to hydrolyze 99% of the culture medium containing 30 g·L-1 starch after 3h. The lyophilization of this enzyme allowed its concentration, increasing the enzymatic activity by 18.88-fold. Still seeking a lower cost, the reduction processes and waste, the use of crude enzymatic extract (CEE) was evaluated without the purification. The CEE was evaluated by enzymatic activity, enzyme characterization, the toxicity of the extract, and the presence of antioxidant compounds. After the analysis, it was possible getting an enzyme with storage stability without the addition of preservatives, with final relative activity greater than 60% after 721 days. The CEE was not toxic against Artemia salina and showed the presence of antioxidants. The crude enzyme showed ideal pH of 6.0, a temperature of 50 °C, and an increase of thermal stability in presence of calcium 2.5 mM. 96% of the starch was hydrolyzed in 3 h, showing a 63-fold increase in enzymatic activity with freeze-drying. The biomass that was a residue in the process was used to produce a protein-rich powder (>or= 26%) with antioxidant activity and no toxicity. This study showed the potential of the Coprinus comatus strain for a-amylase synthesis and production of other important compounds and also to produce by-products with high added value.