Influência dos doadores de hidrogênio provenientes dos solventes eutéticos profundos na separação de diferentes proteínas empregando sistemas de duas fases aquosas

Abstract

Resumo: Sistemas de duas fases aquosas (SDFA) vem sendo amplamente aplicados em estudos de processos de extração e partição de biomoléculas. Estes sistemas são formados em sua maioria por água e pelo menos dois componentes formadores de fase. Para maximizar a eficácia desses sistemas, têm-se buscado alternativas para substituir os formadores convencionais de fases. Nesse âmbito surgem os solventes eutéticos profundos (DES), os quais têm apresentado boa capacidade na separação de diferentes biomoléculas. Entretanto, o alto teor de água presente nos sistemas de duas fases aquosas resulta na quebra das ligações de hidrogênio formadoras dos solventes eutéticos profundos. Essa quebra causa uma partição não estequiométrica entre o doador e receptor de hidrogênio nas fases do SDFA, os quais passam a ser considerados sistemas quaternários. Apesar disso, têm-se verificado que a presença dos constituintes do DES no SDFA é capaz de alterar a características físico-químicas das fases em equilíbrio. O objetivo deste estudo foi avaliar o uso da glucose, xilitol e sorbose, ou seja, diferentes açúcares como moléculas doadoras de hidrogênio na formação de DES compostos por cloreto de colina (N111(2OH))Cl, nas razões molares 2:1, 1:1 e 1:2. Estes solventes foram aplicados como formadores de fases em SDFA com fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) e então avaliados quanto a partição das proteínas BSA, lisozima e colágeno hidrolisado. Foi realizado o levantamento dos dados de equilíbrio dos sistemas, ou seja, obtenção das curvas binodais e as linhas de amarração. Observou-se que a presença dos açúcares não apresentou influência na formação de fases dos sistemas, porém, a natureza e a concentração desses doadores afetam a região bifásica. Verificou-se a formação de uma fase rica em (N111(2OH))Cl e a outra rica em K2HPO4. O coeficiente de partição (K) e a eficiência de extração (EE %) das proteínas nestes sistemas foram avaliados. A menor EE% foi obtida no sistema formado por glucose (1:2) na partição da BSA (19,85%). Esse mesmo sistema apresentou o maior valor de EE% (97,04%) para a partição da BSA em razão molar 2:1. Para a lisozima, todos os doadores de hidrogênio avaliados na razão molar 1:1 apresentaram EE% superior a 90%. A partição do colágeno apresentou melhor EE% (93,04%) no SDFA formado por glucose em razão molar 1:1. Foi possível perceber a presença e a estrutura da molécula doadora de hidrogênio, bem como as características da biomolécula a ser separada influenciam no processo e na eficiência de separação, sendo necessário avaliar cada caso em particular e utilizar os doadores como "designer solvents". Através da análise de dicroísmo circular em comparação qualitativa foi possível perceber que o processo de partição com uso de SDFA bem como a presença dos componentes do sistema, não alteram a estrutura das biomoléculas. Desta forma, os SDFA quaternários podem ser desenvolvidos especificamente e aplicados como um método de separação inócuo as proteínas.

Abstract: Aqueous two-phase systems (ATPS) come widely applied in studies of extraction and partition processes of biomolecules. These systems are formed mostly water and at least two-phase forming components. To maximize the effectiveness of these systems, alternatives have been sought to replace conventional phase formers. In this context arise deep eutectic solvents (DES), which have shown good ability to separate different biomolecules. The high-water content present in aqueous two-phase systems results in the breakdown of hydrogen bonds that form deep eutectic solvents. This breakdown causes a non-stoichiometric partition between the hydrogen donor and acceptor of DES in the ATPS phases, which become quaternary systems. Nevertheless, it has been found that the presence of DES constituents in ATPS can alter the physicochemical characteristics of the equilibrium phases. The aim of this study was to evaluate the use of glucose, xylitol and sorbose, that is, different sugars as hydrogen donor molecules in the formation of DES composed by choline chloride (N111(2OH))Cl, at molar ratios 2:1, 1:1 and 1:2. These solvents were applied as phase builders in SDFA with dibasic potassium phosphate (K2HPO4) and then evaluated for the partition of BSA , lysozyme and hydrolyzed collagen proteins. The systems equilibrium data were collected, that is, the binodal curves and the tie lines were obtained. It was observed that the presence of sugars did not influence the phase formation of the systems, however, the nature and concentration of these donors affect the biphasic region. The formation of a phase rich in (N111 (2OH)) Cl and the other rich in K2HPO4 was observed. The partition coefficient (K) and protein extraction efficiency (EE%) in these systems were evaluated. The smallest EE% was obtained in the system formed by glucose (1:2) in the BSA partition (19.85%). These same systems also presented the highest value obtained (97.04%) in the partition of BSA in the 2:1 molar ratio. For lysozyme all hydrogen donors evaluated at 1:1 molar ratio presented EE% over 90%. Collagen partition showed better EE% (93.04%) in the ATPS formed by glucose in 1:1 molar ratio. It was possible to realize that both the presence and structure of the hydrogen donor molecule, as well as the characteristics of the biomolecule to be separated influence the process of separation and efficiency, being necessary to evaluate each one in particular case and to use the donors as designer solvents. Through the analysis of circular dichroism in qualitative comparison it was possible to realize that the partition process using ATPS as well as the presence of the system components do not alter the structure of the biomolecules. Thus, quaternary SDFAs can be specifically developed and applied as a method of innocuous separation of proteins.