ß-galactosidade de origem microbiana : produção, otimização, escalonamento e caracterização

Abstract

Resumo: O leite e seus derivados são altamente consumidos no mundo. O Brasil destaca-se por ocupar a quinta posição na produção mundial de leite. Embora seu consumo seja crescente, muitos indivíduos apresentam intolerância a lactose. A intolerância ou má digestão da lactose consiste na hipolactasia, ou seja, redução da capacidade do organismo em hidrolisar a lactose. O processo utilizado industrialmente na produção de leite e derivados com teores reduzidos ou isentos de lactose é a hidrólise enzimática pela ação da ?-galactosidase, a qual é produzida principalmente por fontes microbianas (Capítulo I). Embora leveduras do gênero Kluveromyces sp. e fungos do gênero Aspergillus sp. serem utilizados na produção comercial de ?-galactosidase, bactérias láticas são capazes de produzir elevados níveis de enzima. Sendo assim, o objetivo do presente estudo consistiu em avaliar dentre uma espécie de levedura e diferentes espécies de bactérias láticas, potenciais produtoras de ?-galactosidase, estudar fontes de nitrogênio de menor custo para sua produção e otimização e avaliar a possibilidade de escalonamento do processo, com base em parâmetros do cultivo. Além disso, a partir dos dados experimentais, ajustar modelos de produção de biomassa, consumo de substrato e atividade de ?-galactosidase com posterior concentração, purificação parcial e caracterização da mesma. No Capítulo II foram avaliadas diferentes bactérias láticas e levedura na produção de ?- galactosidase e, a partir do micro-organismo selecionado, diferentes fontes de nitrogênio orgânicas foram testadas com o objetivo de reduzir os custos do meio. Dentre os microorganismos avaliados, Lactobacillus reuteri apresentou os maiores níveis de atividade enzimática (1286 U L-1), Pm (28,78 U L h-1) e YP/S (82,32 U g-1). O uso de caseína e levedo de cerveja combinados (3,0 + 3,0 g L-1) no meio MMRS promoveu elevada atividade enzimática (1269 U L-1) com custos 1,83 vezes menores quando comparado ao meio MMRS - extrato de levedura comercial. No Capítulo III realizou-se a otimização das concentrações de lactose, caseína, levedo de cerveja e pH inicial do meio MMRS. Posteriormente, diferentes volumes do meio de cultivo otimizado (200, 800 e 3200 mL) foram testados, além do ajuste de modelos para produção de biomassa, consumo de lactose e atividade de ?-galactosidase. O DCCR permitiu encontrar concentrações ideais de lactose (12,75 g L-1), caseína (1,88 g L-1) e levedo (1,65 g L-1), além do pH do meio MMRS (5,61). O meio de cultivo otimizado resultou em elevada atividade enzimática (7,28 U mL-1), 5,74 vezes superior a verificada antes da otimização (1,27 U mL-1). Observou-se elevada atividade de ?-galactosidase nos diferentes volumes testados (7,75 - 200 mL; 7,10 - 800 mL e 6,46 U mL-1 - 3200 mL), além de elevados valores de Pm e Pp, YP/ e YP/S. Os modelos de Contois e Logístico apresentaram bom ajuste aos dados experimentais de biomassa e substrato. O modelo modificado de Luedeking-Piret permitiu prever a atividade enzimática em função dos valores de biomassa e lactose ajustados pelos modelos de Contois e Logístico. No Capítulo IV testaram-se diferentes métodos de rompimento celular (sonicação, pérolas de vidro com agitação em vórtex e SDS-clorofórmio) visando liberação da ?-galactosidase, além da concentração do extrato enzimático por ultrafiltração, seguida de testes de caracterização (pH, temperatura e efeito de íons metálicos). A sonicação mostrou-se mais eficiente para a liberação da enzima do interior da célula. A ultrafiltração possibilitou concentração de 5,83 vezes no extrato enzimático. Verificou-se que a ?-galactosidase de L. reuteri apresentou maior atividade em pH 7,0 e a 37 ºC. Magnésio, manganês e potássio promoveram incremento na atividade enzimática, enquanto que o cálcio agiu como inibidor de sua atividade.

Abstract: Milk and dairy products are highly consumed in the world. Brazil is the fifth largest milk producer in the world. Although their consumption is increasing, many people have lactose intolerance. Lactose intolerance consists of hypolactasia, i. e., the inability to digest lactose. The industrial process used in milk and dairy products with low levels or lactose-free is called enzymatic hydrolysis by ƒÀ-galactosidase enzyme, which is produced mainly by microbial sources (Chapter I). Although yeasts of the genus Kluveromyces sp. and fungi of the genus Aspergillus sp. are used in the commercial production of ƒÀ-galactosidase, lactic acid bacteria are capable of producing high enzyme levels. The objective of the present study was to evaluate the potential ƒÀ-galactosidase producers among a yeast and several strains of lactic acid bacteria, besides to study lower-cost nitrogen sources for their production and optimization, to evaluate the scaling up process based on growth parameters. Besides, based on experimental data, the adjust of biomass production methods, substrate consumption and ƒÀ-galactosidase activity followed by concentration, purification and characterization of the enzyme were performed. In Chapter II different lactic acid bacteria and yeast were evaluated in the production of ƒÀ- galactosidase and from the selected microorganism, different organic nitrogen sources were tested with the objective of minimize growing medium costs. Among the tested microorganisms, Lactobacillus reuteri showed the highest enzymatic activity levels (1286 U L-1), Pm (28.78 U L h-1) and YP/S (82.32 U g-1). The use of casein and inactive beer yeast combined on MMRS medium showed high enzymatic activity (1269 U L-1) with 1.83 times less expensive when compared with the commercial MMRS. In Chapter III the lactose concentration, casein, inactive beer yeast and pH in MMRS medium were optimized. With the result from the optimization, different volumes of the growing medium (200, 800 and 3200 mL) were evaluated together with the models for biomass production, lactose consumption and ƒÀ galactosidase activity. The DDCR analysis showed the ideal concentration of lactose (12.75 g L-1), casein (1.88 g L-1) and yeast (1.65 g L-1) and the optimal pH (5.61) for the MMRS medium. The optimized growing medium showed high enzymatic activity (7.28 U mL-1) with 5.74 times higher than the growing medium before the optimization (1.27 U mL-1). High ƒÀ-galactosidase activity was observed in all tested volumes (7.75 for 200 mL: 7.10 for 800 mL and 6.46 U mL- 1 for 3200 mL) with high Pm, Pp, YP/X and YP/S. The Contois and Logistic models showed good agreement for the experimental data of biomass and substrate. The modified Luedeking-Piret model allowed the prediction of enzymatic activity as function of biomass and lactose adjusted by the Contois and Logistic models. In Chapter IV, different cell disruption (sonication, glass beads with vortex stirring and SDS-chloroform for ƒÀ-galactosidase liberation were evaluated. Then, the enzymatic concentration by ultrafiltration followed by characterization of pH, temperature and metallic ions effects were tested. The sonication showed the most efficient method for the enzyme release . The ultrafiltration allowed increasing of 5.83 times for the concentration in the enzymatic extract. The ƒÀ-galactosidase produced by L. reuteri showed the highest enzymatic actvity in pH 7.0 and 37 oC. Magnesium, manganese and potassium promoted an increasing in the enzymatic activity, while calcium inhibited the enzymatic activity.