Formação de monocristais de proteínas depositadas sobre grade de cobre (GC) revestida com filme de carbono e analisada ao microscópio eletrônico de transmissão

Abstract

Resumo: Mostramos, neste trabalho, que as proteínas Lisozima e Centrina (BeCen3) depositadas diretamente em grades para microscopia de transmissão revestidas com filme fino de Carbono Bacteriano e lavadas imediatamente após um período de deposição de 5s a 10s, quando analisadas pela técnica de Difração de Elétrons em Área selecionada(DAS), mostram padrões de difração consistentes com as estruturas ortorrômbicas esperadas. A evidência da cristalização em tempos reduzidos, na fase inicial de cristalização, mostra uma promissora técnica para caracterização de proteínas difíceis de obter-se em dimensões maiores do que centenas de nanômetros. Além dos padrões de difração, a forma dos monocristais formados é compatível com as estruturas cristalinas das proteínas depositadas. Na configuração utilizada, sendo a energia do feixe de elétrons de 80keV e L = 60cm, para cristais com altos parâmetros de rede, a técnica de (DAS) somente permite a observação de pontos do espaço recíproco associados com altos índices de Miller. Os pontos de difração observados experimentalmente possuem raios maiores que 9mm. Para raios menores não se observa difração devido ao espalhamento resultante do feixe incidente central. Pudemos reproduzir os padrões de difração, admitindo-se a estrutura ortorrômbica das proteínas analisadas.

Abstract: This work shows that the proteins Lysozyme and Centrin (Becen3) when deposited directly on TEM carbon coted grids and washed after 5s to 10s, when analyzed by Selected Area Diffraction(SAD) technique, show diffraction patterns consistent with the expected orthorhombic structures. The evidences of crystallization after reduced time in the initial crystallization phase, shows a promising technique to characterize proteins difficult to obtain in dimensions larger then hundreds nanometers. Besides the diffraction patterns, the shape of single crystals is compatible with the crystalline structure of the proteins deposited. The setup used with beam energy of 80keV and camera length of 60 cm, for crystals with large lattice spacing, the DAS technique only allows to visualize diffraction spots associated with large Miller index. The diffraction spots radius observed in this work are larger than 9 mm. The spots closer than 9mm are not visible due to the scattering of the incident central beam. We were able to simulates the experimental diffraction patterns assuming the orthorhombic structures published for both proteins.