Avaliação da expressão e mutagênese de genes mutaenvolvidos na nodulaçãode Sinorhizobium fredii NGR234

Abstract

Resumo : A maior parte da atmosfera é formada por nitrogênio gasoso (N2), o qual não pode ser assimilado pela maioria dos organismos. Apenas algumas bactérias e arqueas são capazes de reduzir o nitrogênio atmosférico a amônia (NH3), e são conhecidos como diazotrofos. Dentre as bactérias diazotróficas, o grupo denominado de rizóbios, são capazes de realizar simbiose com plantas e induzir a formação de nódulos, tecidos especializados nos quais ocorre a quebra do dinitrogênio em amônia. Esse processo é conhecido como Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN) e possui grande importância para a agricultura mundial. Devido ao gasto energético do processo, a FBN é regulada em vários níveis e depende da disponibilidade de amônio e oxigênio para as células. Sinorhizobium fredii NGR234 é um rizóbio capaz de realizar nodulação em mais de 112 gêneros de leguminosas, sendo a bactéria mais promíscua conhecida. As primeiras etapas da nodulação envolvem um processo de sinalização molecular entre a planta e o rizóbio. A planta secreta flavonoides que interagem com proteínas do rizóbio reguladoras de transcrição. O rizóbio, por sua vez, responde à planta com a produção de fatores Nod. Vários genes bacterianos estão envolvidos nesse processo, e muitos têm sua expressão regulada por flavonoides. O gene y4aM de NGR234, é um possível regulador transcricional e, em uma análise anterior, teve sua expressão detectada após a exposição de flavonoides. Outros genes identificados como possíveis reguladores transcricionais são os genes mucR1 e mucR2, presentes no cromossomo e no plasmídeo simbiótico, respectivamente. O produto desses genes ainda não possui função elucidada. Para avaliar a expressão gênica em resposta à flavonoides, os promotores dos genes mucR2 e y4aM foram clonados no plasmídeo pPROBE contendo gene repórter GFP, sendo então avaliada a expressão de GFP em cultivos com e sem a adição de flavonoides. Os resultados sugerem que a expressão de ambos os genes é constitutiva, na ausência ou presença de flavonoides. O promotor do gene mucR1 foi amplificado por PCR e inserido no plasmídeo de clonagem pTZ57R/T para futura clonagem no plasmídeo pPROBE. Além disso, uma construção do gene y4aM truncado no vetor pK18mobsacB, obtida em um trabalho anterior foi utilizada para a obtenção de uma estirpe mutante. A construção foi inserida em células de NGR234 e foi selecionada uma colônia simples recombinante, contendo o gene y4aM truncado e o gene completo. A partir de uma nova seleção com sacarose, foram obtidas colônias candidatas a duplo recombinante, contendo apenas a versão truncada do gene, que serão avaliadas fenotipicamente

Abstract : Most of the atmosphere is made up of gaseous nitrogen (N2), which cannot be assimilated by most organisms. Only a few bacteria and archaea are able to reduce atmospheric nitrogen to ammonia (NH3), and these are known as diazotrophs. Among the diazotrophic bacteria, the group known as rhizobia are capable of symbiosis with plants and induce the formation of nodules, specialized tissues in which dinitrogen is broken down into ammonia. This process is known as Biological Nitrogen Fixation (BNF) and is of great importance to agriculture worldwide. Due to the energy expenditure of the process, BNF is regulated at various levels and depends on the availability of ammonium and oxygen to the cells. Sinorhizobium fredii NGR234 is a rhizobium capable of nodulating more than 112 legume genera and is the most promiscuous bacterium known. The first stages of nodulation involve a process of molecular signaling between the plant and the rhizobium. The plant secretes flavonoids that interact with the rhizobium's transcription-regulating proteins. The rhizobium, in turn, responds to the plant by producing Nod factors. Several bacterial genes are involved in this process, and many have their expression regulated by flavonoids. The y4aM gene of NGR234 is a possible transcriptional regulator and, in a previous analysis, its expression was detected after exposure to flavonoids. Other genes identified as possible transcriptional regulators are the mucR1 and mucR2 genes, present in the chromosome and in the symbiotic plasmid, respectively. The product of these genes has yet to be elucidated. To evaluate gene expression in response to flavonoids, the promoters of the mucR2 and y4aM genes were cloned into the pPROBE plasmid containing the GFP reporter gene, and GFP expression was then evaluated in cultures with and without the addition of flavonoids. The results suggest that the expression of both genes is constitutive, in the absence or presence of flavonoids. The mucR1 gene promoter was amplified by PCR and inserted into the pTZ57R/T cloning plasmid for future cloning into the pPROBE plasmid. In addition, a construct of the y4aM gene truncated in the pK18mobsacB vector obtained in a previous study was used to obtain a mutant strain. The construct was inserted into NGR234 cells and a single recombinant colony containing the truncated y4aM gene and the complete gene was selected. From a new selection with sucrose, candidate double recombinant colonies were obtained, containing only the truncated version of the gene, which will be evaluated phenotypically