Avaliação do uso de extração de RNA baseada no método de TRIzol pra determinação da expressão gênica de transportadores ABC em tecidos de mama

Abstract

Resumo: O câncer é a segunda causa de mortes no Brasil e no mundo, sendo considerado um problema de saúde pública mundial. Dentre os tipos de câncer mais incidentes, encontra-se o câncer de mama. Os medicamentos antineoplásicos compõem uma grande classe de agentes farmacológicos que podem ser utilizados no tratamento de diversos tumores, porém, a falha terapêutica continua sendo um dos maiores problemas para o paciente oncológico. Inúmeros mecanismos estão envolvidos na falha da terapêutica, entre eles diferenças farmacocinéticas entre os pacientes, a localização do tumor em locais do organismo onde as drogas não conseguem penetrar facilmente, alterações no microambiente tumoral e, o mais comum, correspondendo a 90% dos mecanismos de falha, o desenvolvimento de mecanismos de resistência à quimioterapia. Dentre os mecanismos de resistência, um dos principais é a superexpressão de transportadores ABC (ATP-Binding Cassette). Esses transportadores realizam o efluxo de drogas através de membranas, diminuindo sua concentração intracelular, o que leva à falha terapêutica e a indução do fenômeno de multirresistência às drogas. Desse modo, a identificação do nível de expressão desses transportadores em diferentes tipos de tumores permite caracterizar o papel dessas proteínas na resposta ao tratamento e também permite predizer a resistência, uma vez que sua expressão pode estar aumentada antes mesmo do tratamento, podendo até mesmo caracterizar essas proteínas como biomarcadores para avaliar a resposta ao tratamento. Além disso, a caracterização dos transportadores pode possibilitar o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, incluindo o desenvolvimento de fármacos, que possam inibir a atividade desses transportadores, com o objetivo de sensibilizar as células tumorais ao tratamento e, consequentemente, prolongar a sobrevida e qualidade de vida do paciente oncológico. Nesse trabalho, RNA total foi extraído de 90 amostras de tecidos de mama normal e tumoral com a utilização de TRIzol. Análises espectrofotométricas foram realizadas para determinação de concentração e qualidade do RNA total extraído e eletroforese em gel de agarose permitiu a avaliação da integridade. Para a grande maioria das amostras, a concentração de RNA total variou de 0,10 a 5,13 ^g/^L, com A260/280 > 1,8. A expressão de transcritos de 20 proteínas ABC além de 3 genes normalizadores foi avaliada por PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Os resultados sugerem que o método de extração de RNA total é eficiente a partir de amostra de tecido de mama humanos e que trabalhos futuros com número de coorte maior permitirão a análise de alteração de nível de expressão como preditor da resistência ao tratamento farmacológico clínica.

Abstract: Cancer is the second leading cause of death in Brazil and worldwide, and it has been considered a worldwide public health problem. Breast cancer is one of the most incident types of cancer worldwide. Antineoplastic drugs comprise a large class of pharmacological agents which can be used to treat a large range of tumors, however, therapeutic failure remains one of the biggest problems for cancer patients. Several mechanisms are involved in therapeutic failure, including pharmacokinetic differences between patients, location of the tumor at places in the body where drugs cannot easily penetrate, changes in the tumor microenvironment and, most commonly, corresponding to 90% of the mechanisms of failure, the development of mechanisms of resistance to chemotherapy. Regarding the mechanisms of resistance, overexpression of ABC family transporters (ATP-Binding Cassette), has been one of the main mechanisms that lead to therapeutic failure. These transporters are responsible for efflux of drugs through membranes, decreasing intracellular concentration of drugs, which leads to the development of multidrug resistance phenome. Therefore, characterization of transporters’ expression in different types of tumors allows the identification of the role that these proteins might have on treatment and also allows to predict resistance to drugs, once overexpression of these transporters may be increased before treatment and may even characterize these proteins as biomarkers to assess the response to treatment. In addition, characterization of transporters enables the development of new therapeutic strategies, including the development of new drugs, which can inhibit the activity of these transporters, sensitizing cancer cells to treatment and, consequently, prolonging survival and improving life’s quality for cancer patients. In this work, total RNA was extracted from 90 samples of normal and tumor breast tissue using TRIzol. Spectrophotometric analyzes were performed to determine the concentration and quality of the total RNA extracted and agarose gel electrophoresis allowed the integrity assessment. For the vast majority of samples, the total RNA concentration ranged from 0.10 to 5.13 g/L, with A260/280 > 1.8. The expression of transcripts of 20 ABC proteins in addition to 3 normalizing genes was evaluated by quantitative real-time PCR (RT-qPCR). The results suggest that the total RNA extraction method is efficient from human breast tissue samples and that future studies with larger cohort numbers will allow the analysis of expression level changes as a predictor of resistance to clinical pharmacological treatment.