Purificação e caracterização da proteína quimérica p50-SBD

Abstract

Resumo : Vacinas são o método mais eficaz de reduzir mortalidade ou morbidade causadas por doenças infecciosas. Existem diversos tipos de vacinas com diferentes mecanismos de ação, como de vírus atenuado, de vírus inativo, de subunidades e outras. Mais recentemente, as vacinas de DNA têm ganhado destaque. Essas são capazes de induzir uma resposta imune celular e humoral, além de serem rápidas, baratas e mais fáceis de serem produzidas em larga escala. Entretanto, as vacinas de DNA apresentam dificuldade na entrega do fármaco, já que o plasmídeo sozinho pode ser degradado pelas nucleases do paciente ou pode não adentrar a célula por conta das cargas negativas do material genético. Desse modo, o uso da proteína quimérica p50-SBD como adjuvante é interessante. A proteína p50 selvagem possui a capacidade de se ligar a uma sequência específica de DNA com alta afinidade, em constantes de dissociação (Kd) em nível de picomolar. Além dessa vantagem, a proteína quimérica p50-SBD é fusionada com um domínio SBD (Substrate Binding Domain) na porção N-terminal. Este domínio confere a habilidade da proteína ligar-se a nanopartículas de PHB (polihidroxibutirato), moléculas biocompatíveis, biodegradáveis e de fácil produção. O uso de nanopartículas conferiria a proteção do material genético da ação proteolítica e facilitaria a incorporação dele pela célula. Este trabalho teve como objetivo geral expressar, purificar e caracterizar a proteína p50-SBD. Para isso, foram feitos testes de expressão e purificação, a fim de determinar as melhores condições para a proteína. Foram realizados, também, ensaios de ligação da proteína p50-SBD ao DNA alvo, para caracterizar como uma ligação específica, e ensaios de ligação às nanopartículas de PHB, para verificar a ligação da proteína ao domínio SBD. Os resultados encontrados mostram que a proteína é capaz de se ligar ao DNA alvo com alta especificidade e, também, é capaz de ser imobilizada pela nanopartícula de polihidroxibutirato (PHB)

Abstract : Vaccines are the most effective method of reducing mortality or morbidity caused by infectious diseases. There are several types of vaccines with different mechanisms of action, such as attenuated virus, inactive virus, subunits, and others. More recently, DNA vaccines have gained attention. They can induce a cellular and humoral immune response, in addition to being fast, inexpensive and easier to produce on a large scale. Yet DNA vaccines have difficulty in drug delivery since the naked plasmid can be degraded by the host nucleases, or it may not enter the cell due to its negative charges. Thus, the use of p50-SBD chimeric protein as an adjuvant is interesting. The wild-type p50 protein can bind to specific DNA sequence with high affinity, at dissociation constants (Kd) at the picomolar level. In addition to this advantage, the p50-SBD chimeric protein is fused with an SBD domain (Substrate Binding Domain) in the N-terminal portion. This domain confers the ability of the protein to bind to PHB (polyhydroxybutyrate) nanoparticles, biocompatible, biodegradable, and easily produced molecules. The use of nanoparticles would protect the genetic material from proteolytic action and facilitate its incorporation by the cell. This work aimed to express, purify and characterize the p50-SBD protein. Therefore, expression and purification tests were performed to determine the best conditions for the protein. Binding assays of the p50-SBD protein to the target DNA were also carried out to characterize a specific binding and binding assays to PHB nanoparticles, to verify the binding of the protein to the SBD domain. The results show that the protein can bind to the target DNA with high specificity and can be immobilized by the polyhydroxybutyrate (PHB) nanoparticle