Eficiência de dois protocolos de extração de DNA em diferentes frações (total e buffy coat) do sangue periférico humano

Abstract

Resumo : A extração de ácidos nucleicos é uma técnica da biologia molecular utilizada para obter amostras de alta qualidade passíveis de preservação por longos períodos. Diante da crescente demanda na obtenção de DNA genômico puro, e isento de contaminantes, para análises em diversos campos de estudo, diferentes metodologias foram desenvolvidas visando o aumento da eficiência, redução de custos e otimização do tempo. No presente trabalho, as variáveis do tempo e condição de preservação, e relação custo-benefício, foram analisadas baseadas em um banco de dados construído a partir de extrações de DNA executadas no período de novembro de 2021 a novembro de 2022 (n = 537). Para isso, foram realizadas, utilizando o software Jamovi e linguagem R, análises estatísticas e descritivas baseadas no tipo de protocolo adaptado empregado (sangue total = ST; camada leucocitária = BUFFY), sobre os valores de pureza (260 nm/280 nm), contaminação por componentes orgânicos (260 nm/230 nm) e concentração (DNA em ng/µL), obtidos em espectrofotômetro NanoDrop™. De forma complementar, as amostras foram classificadas, de acordo com os valores de quantificação, como grupo ESTOQUE (pureza entre 1,8 e 1,9 e contaminação entre 1,9 e 2,4), grupo AVALIAR (pureza ou contaminação diferente de ESTOQUE) e grupo CRÍTICO (concentração menor que 20 ng/µL). As amostras extraídas demonstraram ter boa qualidade (260/280 = 1,82; 260/230 = 2,11), apesar da grande variação entre pureza (de 0,530 a 5,41) e contaminação (de -26,620 a 33,44), possivelmente advindas de erros de manipulação entre os métodos de estudo. O protocolo BUFFY apresentou valores significativamente maiores (DNA = 195 ng/µL; 260/280 = 1,84; 260/230 = 2,27) comparados aos de ST (DNA = 112 ng/µL, 260/280 = 1,79; 260/230 = 1,80) (Mann Whitney; p < 0,001). O grupo ESTOQUE foi o único a resultar em diferenças significativas entre os protocolos (BUFFY: DNA = 253 ng/µL, 260/280 = 1,84; 260/230 = 2,29; ST: DNA = 441 ng/µL, 260/280 = 1,83; 260/230 = 2,11) (Kruskal Wallis; Dwass-Steel-Critchlow-Fligner (DSCF); p < 0,001). O recongelamento das amostras em ST não mostrou associação significativa para a concentração (Kruskal Wallis; DSCF; p > 0,05). A diferença de dias entre a coleta e a extração apresentou correlações negativas significativas (Spearman; p < 0,001) para a pureza (BUFFY: ? = -0,375; ST = ? = -0,276) e contaminação (BUFFY: ? = -0,333; ST = ? = -0,373) e não significativas para concentração em ST (Spearman; p > 0,05). Novas análises são necessárias em condições controladas com amostras pareadas para melhor avaliar essas associações em estudo. O protocolo de extração BUFFY apresentou a melhor relação custo-benefício comparado a de ST, visto a diminuição e padronização de etapas, aumento na capacidade de processamento e redução do tempo de execução. Nossos resultados destacam a viabilidade dos dois protocolos adaptados a partir de um mesmo kit comercial, com a escolha do melhor método influenciada pela capacidade de manter alta eficiência somada a otimização dos recursos disponíveis

Abstract : Nucleic acid extraction is a molecular biology technique used to obtain high quality samples that can be preserved for long periods of time. Given the growing demand for pure, contaminant-free genomic DNA for analysis in various fields of study, different methodologies have been developed to increase efficiency, reduce costs and optimize time. In this study, the variables of preservation time and condition, and the cost-benefit ratio, were analyzed based on a database built from DNA extractions carried out between November 2021 and November 2022 (n = 537). To this end, statistical and descriptive analyses were carried out using the Jamovi software and the R language, based on the type of adapted protocol used (whole blood = ST; leukocyte layer = BUFFY), on the purity values (260 nm/280 nm), contamination by organic components (260 nm/230 nm) and concentration (DNA in ng/µL), obtained using a NanoDrop™ spectrophotometer. In addition, the samples were classified, according to the quantification values, as STOCK group (purity between 1.8 and 1.9 and contamination between 1.9 and 2.4), EVALUATE group (purity or contamination different from STOCK) and CRITICAL group (concentration less than 20 ng/µL). The extracted samples proved to be of good quality (260/280 = 1.82; 260/230 = 2.11), despite the wide variation between purity (from 0.530 to 5.41) and contamination (from -26.620 to 33.44), possibly due to handling errors between the study methods. The BUFFY protocol showed significantly higher values (DNA = 195 ng/µL; 260/280 = 1.84; 260/230 = 2.27) compared to ST (DNA = 112 ng/µL, 260/280 = 1.79; 260/230 = 1.80) (Mann-Whitney; p < 0.001). The STOCK group was the only one to result in significant differences between the protocols (BUFFY: DNA = 253 ng/µL, 260/280 = 1.84; 260/230 = 2.29; ST: DNA = 441 ng/µL, 260/280 = 1.83; 260/230 = 2.11) (Kruskal-Wallis; Dwass-Steel-Critchlow-Fligner (DSCF); p < 0.001). Refreezing the samples in ST showed no significant association with concentration (Kruskal-Wallis; DSCF; p > 0.05). The difference in days between collection and extraction showed significant negative correlations (Spearman; p < 0.001) for purity (BUFFY: ? = -0.375; ST = ? = -0.276) and contamination (BUFFY: ? = -0.333; ST = ? = -0.373) and not significant for concentration in ST (Spearman; p > 0.05). New analyses are needed under controlled conditions with paired samples to better evaluate these associations under study. The BUFFY extraction protocol showed the best cost-benefit ratio compared to ST, given the reduction and standardization of steps, increased processing capacity and reduced execution time. Our results highlight the viability of the two protocols adapted from the same commercial kit, with the choice of the best method influenced by the ability to maintain high efficiency in addition to optimizing available resources