Avaliação da capacidade protetiva de uma vacina contra o loxoscelismo sistêmico e cutâneo desenvolvida com fosfolipases-D recombinantes mutadas

Abstract

Resumo : As aranhas do gênero Loxosceles, conhecidas como aranhas-marrom, são os agentes do loxoscelismo, quadro clínico ocasionado pela sua picada. O envenenamento gera uma lesão dermonecrótica que em casos mais graves pode levar ao óbito, sendo assim, um desafio para a saúde pública no Brasil. O veneno dessas aranhas contém uma mistura de enzimas, glicoproteínas e peptídeos com destaque para as fosfolipases-D (FLDs), descritas como toxinas dermonecróticas, que sozinhas têm a capacidade de reproduzir experimentalmente quase todos os sintomas do loxoscelismo. FLDs recombinantes com mutações sítio-dirigidas foram desenvolvidas revelando a importância de aminoácidos-chave no processo catalítico e tóxico. Além disso, apesar do alto número de acidentes, o tratamento do loxoscelismo ainda não é padronizado, envolvendo a aplicação de soros antiloxoscélicos em casos sistêmicos moderados e graves, mas a eficácia depende da administração rápida, o que é desafiado pela picada muitas vezes indolor e pela falta de um diagnóstico específico. Sendo assim, o objetivo desse trabalho é avaliar a capacidade protetiva de uma vacina loxoscélica frente aos danos locais e sistêmicos utilizando fosfolipases-D recombinantes mutadas no reconhecimento do substrato, atividade catalítica e coordenação do cofator da enzima (LiRecDT1-W230A, LlRecDT1H12-H47A e LgRecDT1E32-D34A, respectivamente) como antígeno. As construções com as fosfolipases-D mutadas foram transformadas em cepas de bactérias BL21(DE3) pLysS, expressas, purificadas e sua pureza avaliada através de uma eletroforese em gel de poliacrilamida. Em seguida, camundongos e coelhos foram vacinados com 3 doses contendo um pool das FLDs mutadas para avaliar as proteções sistêmica e cutânea, respectivamente. O esquema vacinal dos camundongos consistiu em 100, 60 e 30 µg de proteína e dos coelhos foram testadas duas formulações, de maior (300, 600 e 1000 µg) e menor massa (75, 150 e 250 µg). Em seguida, o soro dos coelhos foi coletado e realizado o ensaio de ELISA. A proteção sistêmica foi demonstrada com 90% de sobrevivência dos camundongos vacinados e desafiados com veneno de L. intermedia. Já em coelhos, foi observada macroscopicamente a diminuição da lesão cutânea dos grupos vacinados em relação aos controles, além da redução de 70% da área de dermonecrose até 96h e 60% do edema durante todo o tempo de análise. Com o ensaio de ELISA pôde-se comprovar a produção dos anticorpos nos animais. Portanto, os resultados desse estudo têm importância científica e biotecnológica, já que reforçam a utilização de FLDs mutadas como antígenos e demonstram sua eficácia e segurança. Além disso, poderá contribuir futuramente para a produção de insumos empregados no tratamento ou prevenção do loxoscelismo

Abstract : Spiders from the Loxosceles gender, also known as Brown spiders, are agents of loxoscelism, a clinical condition caused by its sting. Envenoming generates a dermonecrotic lesion that in more severe cases can lead to death, therefore, becoming a challenge to public health in Brazil. The venom from these spiders contains a mix of enzymes, glycoproteins and peptides, with an emphasis on phospholipases D (PLDs), described as dermonecrotic toxins, that by themselves have the capacity to experimentally reproduce almost every symptom of loxoscelism. Recombinant PLDs with site-directed mutations were developed showing the importance of key amino acids on the catalytic and toxic process. Besides that, despite the high number of accidents, loxoscelism treatment is still not standard, involving the application of anti loxoscelic serum in moderate and severe systemic cases, but the efficiency depends on quick administration, which is challenging due to usually painless stings and to the lack of a specific diagnosis. Therefore, the objective of this work is to evaluate the protective capacity of a loxoscelic vaccine facing local and systemic damages using recombinant mutated phospholipases D on the recognition of substrate, catalytic activity, and enzyme cofactor coordination (LiRecDT1 W230A, LlRecDT1 H12-H47A and LgRecDT1 E32-D34A, respectively) as antigen. The construction of mutated phospholipases D were transformed into strains of bacteria BL21(DE3) pLysS, expressed, purified and its purity evaluated through an electrophoresis in polyacrylamide gel. Next, mice and rabbits were vaccinated with 3 doses containing a pool of mutated PLDs to evaluate the systemic and cutaneous protections, respectively. The vaccination scheme for mice consisted in 100, 60 and 30 µg of protein, and for rabbits two formulations were tested, with larger (300, 600 and 1000 µg) and smaller (75, 150 and 250 µg) mass. Then, the rabbit serum was collected, and the ELISA assay was performed. The systemic protection was demonstrated with 90% survival rate of vaccinated mice and challenged with L. intermedia venom. In rabbits, the decrease of cutaneous lesion of vaccinated groups was macroscopically observed in comparison to the control group, besides a 70% reduction of dermonecrosis area in 96 hours, and 60% of the edema during the whole analysis period. With the ELISA assay it was able to prove the production of antibodies on animals. Thus, the results of this study have scientific and biotechnological importance since it reinforces the utilization of mutated PLDs as antigens and shows its efficiency and safety. Furthermore, it will be able to contribute to the production of inputs used on the treatment or prevention of loxoscelism in the future