Caracterização da enzima N-acetil-L-glutamatoquinase (NAGK) e sua possível interação com as proteínas PII (GlnZ e GlnB) em Azospirillum brasilense

Abstract

Resumo: A alfa-proteobactéria Azospirillum brasilense é amplamente estudada e possui relevância econômica devido à sua capacidade de promover o crescimento vegetal por meio da fixação biológica de nitrogênio e da produção de fitormônios. Entre as vias envolvidas no destino do nitrogênio fixado, destaca-se a biossíntese de arginina, na qual a N-acetil-L-glutamato quinase (NAGK) catalisa uma etapa regulatória a partir do glutamato em organismos que realizam o ciclo de síntese de ornitina. A arginina é um aminoácido-chave como fonte de nitrogênio, atuando como precursora de poliaminas em A. brasilense e da ureia, compostos que podem ser transferidos à planta hospedeira durante a associação. Em microrganismos, a NAGK pode apresentar duas formas estruturais: dimérica, insensível à arginina (como em E. coli), e hexamérica, sensível à arginina (como em cianobactérias). Nessa última, a regulação é mediada por proteínas PII, reguladoras e transdutoras de sinal, interação que não ocorre em E. coli. Em A. brasilense, entretanto, não há dados consolidados sobre a interação entre as PII (GlnB e GlnZ) e a NAGK hexamérica. Considerando a relevância dessa via, o presente trabalho buscou caracterizar a NAGK de A. brasilense (AbNAGK) quanto à atividade enzimática, estrutura e interação com as proteínas PII GlnZ e GlnB, além de avaliar a influência de metabólitos e modificações estruturais sobre sua função. Para atingir esses objetivos, a proteína foi purificada com cauda de histidina e também em sua forma nativa, a partir de vetores de produzidos em E. coli. As proteínas NAGK e PII foram purificadas por cromatografia de afinidade ou troca iônica com subsequente remoção de caudas de histidina quando aplicável. Foram realizados ensaios de interação proteína-proteína (pull-down) fotometria de massas, cinética enzimática e cromatografia por exclusão de tamanho para elucidar o estado oligomérico e possíveis complexos formados. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos de efetores como ATP e 2-oxoglutarato, bem como a sensibilidade à arginina. Os resultados sugerem que a presença da cauda de histidina na porção N-terminal de AbNAGK influencia sua oligomerização, favorecendo a formação de dímeros e alterando a sensibilidade à arginina, em contraste com a enzima nativa que mantém o estado hexamérico típico. As proteínas PII interagem com AbNAGK nativa de forma dependente de efetores, sugerindo um mecanismo de regulação fino em resposta ao estado nitrogenado celular. A análise cinética de NAGK-his indicou valores de Km e kcat acima dos reportados para NAGKs bacterianas, indicando mal funcionamento da enzima nas condições testadas. Desse modo, a partir dos resultados observados, conclui-se que a AbNAGK precisa de sua região N terminal livre para adotar a conformação hexamérica, condição necessária para a interação com as proteínas PII, observadas aqui na presença do efetor ATP, e para a função catalítica da enzima

Abstract: The alpha-proteobacterium Azospirillum brasilense is widely studied and has economic relevance due to its ability to promote plant growth through biological nitrogen fixation and the production of phytohormones. Among the pathways involved in the fate of fixed nitrogen, arginine biosynthesis stands out, in which N-acetyl-L-glutamate kinase (NAGK) catalyzes a regulatory step from glutamate in organisms that perform the ornithine synthesis cycle. Arginine is a key amino acid as a nitrogen source, acting as a precursor of polyamines in A. brasilense and of urea, compounds that can be transferred to the host plant during the association. In microorganisms, NAGK can occur in two structural forms: dimeric, insensitive to arginine (as in E. coli), and hexameric, arginine-sensitive (as in cyanobacteria). In the latter, regulation is mediated by PII proteins, regulatory and signal-transducing proteins, an interaction that does not occur in E. coli. In A. brasilense, however, there are no consolidated data on the interaction between PII proteins (GlnB and GlnZ) and the hexameric NAGK. Considering the relevance of this pathway, the present work aimed to characterize A. brasilense NAGK (AbNAGK) in terms of enzymatic activity, structure, and interaction with the PII proteins GlnZ and GlnB, as well as to evaluate the influence of metabolites and structural modifications on its function. To achieve these objectives, the protein was purified with a histidine tag and also in its native form, from vectors expressed in E. coli. NAGK and PII proteins were purified by affinity or ion-exchange chromatography with subsequent removal of histidine tags when applicable. Protein–protein interaction assays (pull-down), mass spectrometry, enzyme kinetics, and size-exclusion chromatography were performed to elucidate the oligomeric state and possible complexes formed. In addition, the effects of effectors such as ATP and 2-oxoglutarate were evaluated, as well as arginine sensitivity. The results suggest that the presence of the histidine tag at the N-terminal region of AbNAGK influences its oligomerization, favoring dimer formation and altering arginine sensitivity, in contrast to the native enzyme, which maintains the typical hexameric state. The PII proteins interact with native AbNAGK in an effector-dependent manner, suggesting a fine regulatory mechanism in response to the cellular nitrogen status. Kinetic analysis of His-tagged NAGK indicated Km and kcat values higher than those reported for bacterial NAGKs, pointing to malfunctioning of the enzyme under the tested conditions. Thus, based on the observed results, it can be concluded that AbNAGK requires a free N-terminal region to adopt the hexameric conformation, a condition necessary for interaction with PII proteins observed here in the presence of the effector ATP and for the catalytic function of the enzyme