Mutagênese e caracterização dos genes y4aM e y4fQ de Sinorhizobium fredii NGR234

Abstract

Resumo : O nitrogênio gasoso (N2), forma mais abundante desse elemento, não é assimilável pela maioria dos organismos – inclusive as plantas. Apenas alguns microrganismos, denominados diazotrofos, são capazes de realizar a conversão de N2 em amônia, através do complexo enzimático da nitrogenase. Sinorhizobium fredii NGR234 é uma bactéria diazotrófica que se associa a plantas e induz a formação de nódulos, onde ocorre a fixação de nitrogênio. S. fredii NGR234 apresenta a maior gama de hospedeiros conhecida, sendo capaz de nodular mais de 112 gêneros de leguminosas. O processo de nodulação é iniciado a partir da quimioatração dos rizóbios por flavonoides secretados pelas raízes das plantas. Os flavonoides interagem com reguladores transcricionais NodD dos rizóbios, que induzem a transcrição de genes nod e outros genes envolvidos na nodulação. Alguns dos genes ativados após a exposição a flavonoides são y4aM e y4fQ. Os produtos destes genes não têm suas funções estabelecidas, mas a análise das sequências sugere que são possíveis reguladores transcricionais. O objetivo deste trabalho é caracterizar estes genes através de mutagênese. A estratégia adotada para a mutagênese de y4fQ foi a deleção simples pois não há risco de interferência em genes próximos. O gene y4fQ foi amplificado e clonado no vetor pTZ57 e a construção foi confirmada através de PCR. Este plasmídeo será clivado para liberar a parte central do gene e obter a forma truncada contendo apenas o início e o final do y4fQ. Para o gene y4aM, a estratégia foi a deleção em fase, pois este gene está próximo e na mesma orientação do gene syrB. As regiões inicial e final do gene y4aM foram amplificadas e clonadas separadamente no vetor pTZ57 e as construções foram confirmadas através de PCR. Os primers utilizados para este gene inseriram sítios de restrição que permitiram a ligação dos fragmentos e a obtenção do gene truncado. Os fragmentos das regiões inicial e final de y4aM foram clivados do vetor pTZ57 e ligados ao vetor pK18mobsacB, originando uma construção com a forma truncada do gene. Esta construção foi confirmada por PCR e sequenciamento e transformada em células de E. coli S17.1. As colônias obtidas foram conjugadas com NGR234 e as células que sofreram recombinação foram selecionadas e confirmadas por PCR (simples recombinantes). A partir da seleção em meio com sacarose foram obtidos 66 possíveis duplo recombinantes que ainda serão confirmados. As estirpes mutantes obtidas a partir destas construções serão avaliadas quanto a sua capacidade de nodulação em comparação com a estirpe selvagem

Abstract : Gaseous nitrogen (N2), the most abundant form of this element, cannot be assimilated by most organisms - including plants. Only a few microorganisms, diazotrophs, can convert N2 into ammonia via the nitrogenase enzyme complex. Sinorhizobium fredii NGR234 is a diazotrophic bacterium that associates with plants and induces nodule formation, where nitrogen fixation occurs. S. fredii NGR234 has the widest known host range and can nodulate more than 112 legume genera. The nodulation process is initiated by the chemoattraction of rhizobia by flavonoids secreted by plant roots. The flavonoids interact with NodD transcriptional regulators of rhizobia, which induce the transcription of nod genes and other genes involved in nodulation. Some of the genes activated after flavonoid exposure are y4aM and y4fQ. The products of these genes do not have their functions established, but sequence analysis suggests that they are possible transcriptional regulators. The objective of this work is to characterize these genes by mutagenesis. The strategy adopted for the mutagenesis of y4fQ was simple deletion because there is no risk of interference with nearby genes. The y4fQ gene was amplified and cloned into the pTZ57 vector and the construct was confirmed by PCR. This plasmid will be cleaved to release the central part of the gene and obtain the truncated form containing only the beginning and the end of y4fQ. The strategy for the y4aM gene was in-phase deletion because this gene is close and in the same orientation as the syrB gene. The start and end regions of the y4aM gene was amplified and cloned separately into the pTZ57 vector and the constructs were confirmed by PCR. The primers used for this gene inserted restriction sites that allowed the binding of the fragments and the truncated gene to be obtained. The fragments of the initial and final regions of y4aM were cleaved from the pTZ57 vector and ligated to the pK18mobsacB vector, originating a construct with the truncated form of the gene. This construct was confirmed by PCR and sequencing and transformed into E. coli S17.1 cells. The obtained colonies were conjugated with NGR234 and the cells that underwent recombination were selected and confirmed by PCR (simple recombinants). From the selection on sucrose medium, 66 possible double recombinants were obtained that are still to be confirmed. The mutant strains obtained from these constructs will be evaluated for their nodulation ability compared to the wild-type strain