Caracterização estrutural do domínio funcional da fosfatase ALPH1 de Trypanosoma cruzi

Abstract

Resumo : A fosfatase ALPH1, de tripanossomatídeos, desempenha um papel crucial na regulação da expressão gênica ao remover o cap4, uma estrutura que evita o decaimento 5’- 3’ e dá estabilidade aos mRNAs. Apesar de apresentar características semelhantes a uma enzima de decapping, a ALPH1 não compartilha homologia com as enzimas de decapping encontradas em mamíferos. Essa distinção a torna um potencial alvo promissor para tratamentos específicos contra a Doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. A compreensão detalhada da estrutura dessa enzima é vital para sua utilização no desenvolvimento de ferramentas terapêuticas mais eficazes e menos agressivas. A análise estrutural de proteínas e ácidos nucleicos desempenha um papel fundamental na compreensão molecular dos sistemas biológicos. Uma abordagem para investigar a relação entre a estrutura e a função de proteínas de interesse envolve a cristalização de macromoléculas, seguida pela difração de raios-X. A validade do uso de estruturas cristalinas na análise das propriedades e funções de macromoléculas é respaldada pela preservação da estrutura molecular durante o processo de cristalização. Esses avanços são essenciais para impulsionar a engenharia de proteínas e o design de medicamentos. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o domínio funcional da fosfatase TcALPH1 a partir da determinação da estrutura tridimensional da enzima por cristalografia de raio-X. Para tanto, foram conduzidos testes de expressão em diferentes cepas e condições, bem como diferentes condições e técnicas de purificação com o objetivo de produzir quantidades suficientes da proteína para viabilizar a cristalização e definir sua estrutura tridimensional. Nas condições testadas, as análises físico-químicas utilizando a técnica de espalhamento dinâmico da luz (DLS) e fluorimetria de varredura nano-diferencial (nanoDSF), revelaram que a fração purificada da fosfatase TcALPH1 apresenta alto índice de polidispersividade e instabilidade térmica, o que desfavoreceu a obtenção de cristal para prosseguir com os testes de difração de raio-x. Entretanto, vários protocolos de expressão e purificação da proteína foram otimizados no laboratório, contribuindo de forma significativa para a continuidade do trabalho e a determinação da estrutura tridimensional de TcALPH1 pelo grupo de estudo

Abstract : The trypanosomatid phosphatase ALPH1 plays a critical role in regulating gene expression by removing cap4, a structure that prevents 5'-3' decay and provides stability to mRNAs. Although ALPH1 has similar properties to a decapping enzyme, it does not share homology with mammalian decapping enzymes. This difference makes it a promising potential target for specific treatments against Chagas disease, which is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi. A detailed understanding of the structure of this enzyme is essential for its use in the development of more effective and less aggressive therapeutic tools. Structural analysis of proteins and nucleic acids plays a fundamental role in the molecular understanding of biological systems. One approach to investigating the relationship between structure and function of proteins of interest is to crystallize macromolecules followed by X-ray diffraction. The validity of using crystal structures to analyze the properties and functions of macromolecules is supported by the preservation of the molecular structure during the crystallization process. These advances are essential for boosting protein engineering and drug design. In this context, the aim of this work was to characterize the functional domain of TcALPH1 phosphatase by determining the three-dimensional structure of the enzyme using X-ray crystallography. To this end, expression tests were carried out in different strains and conditions, as well as different purification conditions and techniques, with the aim of producing sufficient quantities of the protein to allow crystallization and determination of its three-dimensional structure. Under the conditions tested, physicochemical analyses using dynamic light scattering (DLS) and nano-differential scanning fluorimetry (nanoDSF) revealed that the purified TcALPH1 phosphatase fraction had a high polydispersity index and thermal instability, making it difficult to obtain a crystal to proceed with X-ray diffraction studies. However, several protocols for the expression and purification of the protein were optimized in the laboratory, which contributed significantly to the continuity of the work and the determination of the three-dimensional structure of TcALPH1 by the study group