Identificação de novos inibidores de transportadores ABC através de uma estratégia de reposicionamento de fármacos

Abstract

Resumo: O câncer é um grupo de mais de 100 doenças. A etiologia multifatorial do câncer está associada a fatores genéticos e ambientais, que desempenham um papel fundamental na oncogênese. Os tratamentos contra o câncer incluem cirurgia, radioterapia e quimioterapia. A eficácia da quimioterapia pode ser reduzida por diversos mecanismos, entre eles a presença de proteínas na membrana das células cancerígenas, responsáveis pelo efluxo do quimioterápico. Este efluxo é especificamente mediado por transportadores ABC. Os dois transportadores ABC mais importantes responsáveis pela Múltipla resistência a drogas (MDR) no câncer são a P-glicoproteína (P-gp) e ABCG2. Para superar a MDR mediada pelos transportadores ABC, inibidores dessas proteínas têm sido utilizados em associação com os agentes quimioterápicos para aumentar a taxa de resposta terapêutica. Neste trabalho, uma estratégia de reposicionamento de fármacos foi utilizada para identificar novos inibidores de ABCG2. Por meio de uma triagem inicial, entre 45 medicamentos utilizados como inibidores de ABCG2, apenas o mitotano foi identificado como um inibidor. Esta triagem foi realizada em células HEK293-ABCG2 transfectadas de forma estável por citometria de fluxo usando duas concentrações, a concentração de fármaco no plasma (Cp) e outra 10 vezes maior. O mitotano inibiu a atividade dos transportadores, cujos valores de IC50 (concentração que produz metade da inibição máxima) foram 36,4 e 298,4 µM para inibição de ABCG2 e P-gp, respectivamente. Ensaios de viabilidade celular revelaram que o mitotano não é transportado por ABCG2 e P-gp. O ensaio conformacional anticorpo-shift mostrou que o mitotano aumenta a reorganização anti-ABCG2, em contraste com a ausência de efeito observada na ligação do anticorpo anti-P-gp. A análise do docking molecular revelou um padrão diferente para a ligação do mitotano em ABCG2 e P-gp. Diferentemente da P-gp, onde mitotano e substratos se ligam em sítios diferentes, foi observada uma sobreposição entre mitotano e substratos na mesma região de ABCG2. Finalmente, um ensaio de viabilidade celular usando células HEK293-ABCG2 revelou que a associação do mitotano na concentração de Cp com o metabólito ativo do quimioterápico irinotecano (SN-38), quimiossensibilizou células que superexpressam ABCG2. Juntos, esses resultados sugerem que o mitotano é uma droga promissora para futuros ensaios clínicos em pacientes com câncer apresentando MDR devido à superexpressão de ABCG2.

Abstract: Cancer is a group of more than 100 diseases. The multifactorial etiology of cancer is associated with genetic and environmental factors, that play a key role in oncogenesis. Cancer treatments include surgery, radiotherapy and chemotherapy. The efficacy of chemotherapy can be reduced by several mechanisms, including the presence of proteins in the membrane of cancer cells, responsible for the efflux of the chemotherapeutic agent. This efflux is specifically mediated by ABC transporters. The two most important ABC transporters responsible for MDR in cancer are P-glycoprotein (P-gp) and ABCG2. To overcome the multidrug resistance (MDR) mediated by ABC transporters, inhibitors of these proteins have been used in association with the chemotherapeutic agents to increase the therapeutic response ratio. In this work, a drug repositioning strategy was used to identify new ABCG2 inhibitors. Through an initial screening of 45 drugs as ABCG2 inhibitors, only mitotane was identified as an inhibitor. This screening was performed in stably transfected HEK293-ABCG2 cells by flow cytometry using the plasma drug concentration (Cp) and 10-fold this Cp value. Mitotane also inhibited P-gp activity. The IC50 values (concentration that produce half of maximal inhibition) were 36.4 and 298.4 ìM for ABCG2 and P-gp inhibition, respectively. Cell viability assays revealed that mitotane is not transported by ABCG2 and P-gp. The conformational antibody-shift assay showed that mitotane increase the anti- ABCG2 reorganization, in contrast to the absence of effect observed in the binding of the anti-P-gp antibody. Analysis of molecular docking revealed a different pattern for the binding of mitotane on ABCG2 and P-gp. Differently of P-gp, where mitotane and substrates bound at different sites, it was observed an overlap between mitotane and substrates in the same region of ABCG2. Finally, a cell viability assay using HEK293-ABCG2 cells revealed that the association of the mitotane at Cp concentration with the active metabolite of chemotherapy SN-38 chemosensitize cells overexpressing ABCG2. Together, these results suggest that mitotane is a promising drug for future clinical trials in cancer patients showing MDR due the overexpression of ABCG2.