Phage display para identificação de peptídeos ligantes à superfície de formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi derivadas de culturas de células

Abstract

Resumo: A tripanossomíase americana, causada pelo Trypanosoma cruzi, é de caráter crônico e progressivo. Até o momento, não há vacinas ou medicações eficazes para a cura da enfermidade. A superfície do parasito apresenta um repertório diversificado de moléculas que podem ser utilizadas como alvo por moléculas ligantes conjugadas com fármacos para desenvolver novas terapias antichagásicas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi identificar peptídeos que interagem com a superfície de formas tripomastigotas derivadas de cultivo celular (TCT) através da técnica de Phage display, utilizando uma biblioteca de peptídeos denominada X15. Para o processo de seleção, quatro rounds de biopanning foram feitos. Clones de bacteriófagos selecionados foram sequenciados e submetidos a análise de BLASTp utilizando dados de proteoma humano. As sequências apresentaram homologia com proteínas dos hospedeiros mamíferos, principalmente com as imunoglobulinas. Nossos resultados sugerem que esses peptídeos identificados podem mimetizar possíveis interações parasito-hospedeiro. A capacidade de ligação dos fagos selecionados foi avaliada pelo teste de ELISA, sendo que 6 clones mostraram fortes interações com o parasito. O peptídeo de maior reatividade, denominado T2, foi sintetizado e testado em ensaios de invasão e ensaios de viabilidade. Os resultados mostram que o peptídeo prejudicou a capacidade das formas tripomastigotas de invadir monocamadas celulares em todas as concentrações utilizadas, indicando que o peptídeo pode interagir com sítios importantes para o processo de infecção do parasito. Por outro lado, o peptídeo não demonstrou toxicidade para os parasitos e para as células hospedeiras (LLC-MK2). Os resultados descritos aqui reforçam nossa ideia de que alvejar a superfície de TCTs pode constituir uma boa estratégia para prejudicar o processo de infecção do parasito e para o desenvolvimento de moléculas terapêuticas alternativas.

Abstract: American trypanosomiasis is caused by Trypanosoma cruzi, showing a chronic and progressive stage. Until now, there is no vaccine or effective medications to cure this disease. The parasite surface shows a diverse repertoire of molecules that can be used as target by ligand molecules conjugated with drugs to develop new antichagasic therapies. Thus, mail goal of the present work is to identify peptides that interact with the surface of tissue-culture derived trypomastigotes (TCT) through the Phage display technique using a peptide library named X15. For the selection process, four rounds of biopanning were performed. Selected bacteriophage clones were sequenced and subjected to BLASTp analysis against human proteome data. The sequences showed homology to mammalian host proteins, mainly to immunoglobulins. Our results suggest that these identified peptides may mimic possible parasite-host interactions. The binding capacity of the selected phages were validated by ELISA, where 6 clones showed strong interactions with the parasite. The most reactive peptide, named T2, was synthesized and tested in invasion assays and viability assays. The results show that the peptide impaired the ability of trypomastigotes forms to invade cell monolayers in all tested concentrations, indicating that the peptide may interact with sites important for the parasite infection process. On the other hand, the peptide showed no toxicity to the parasites or host cells (LLC-MK2 cells). The results described here reinforces our idea that targeting TCT surface can be a good strategy to impair parasite infection, and can be used to develop alternative therapeutic molecules.