Padronização a extração de RNA, DNA e proteínas utilizando trizol a partir de amostras de células e tecidos humanos

Abstract

Resumo: O câncer é um dos principais problemas de saúde pública no mundo, sendo a segunda principal causa de morte. As abordagens de tratamento de câncer incluem ressecção cirúrgica, radioterapia e terapia sistêmica farmacológica, como quimioterapia. No entanto, a resistência a múltiplas drogas (MDR) é um problema de grande importância no tratamento antineoplásico. O principal mecanismo de MDR envolve a superexpressão de transportadores ATP-binding cassette (ABC). Os transportadores ABC realizam o efluxo de quimioterápicos antineoplásicos, diminuindo seu acúmulo em células resistentes. Portanto, a investigação das alterações nos níveis de expressão dos transportadores ABC como biomarcadores de MDR clínica é relevante para predizer fatores prognósticos e terapêuticos do câncer. Entretanto, o grande desafio para realizar a análise molecular de amostras clínicas é a baixa quantidade e qualidade de RNA, DNA e proteínas isolados. Além disso, para manipulação de pequenas quantidades de amostras, como biópsias de tumores, um único método de extração é crucial para obter macromoléculas para análises posteriores. Neste trabalho, a fim de superar essas limitações foi apresentado um método baseado em TRIzol para recuperação simultânea de RNA, DNA e proteínas de células e tecidos humanos. O rendimento de RNA total dependeu da natureza da amostra, tecido ou célula, mas foi de 667 ng/mg de tecido (n=51) ou 4,6 µg/106 células, com razão de absorbância 260/280 de 1,8-2,0. DNA e proteínas resultaram em rendimento médio de 225 ng/mg de tecido e 2,7 µg/mg de tecido, respectivamente. Os resultados mostraram que este método pode ser usado para detectar eficientemente genes que codificam para transportadores ABC por RT-qPCR, DNA genômico e genotipagem de TNFR1 rs767455, e proteínas por eletroforese em gel e western blot, independentemente da natureza do amostra. Devido à capacidade de isolar RNA, DNA e proteínas da mesma amostra, seu baixo custo, alto rendimento e qualidade das macromoléculas obtidas, este método será vantajoso em futuros estudos de diversos biomarcadores em câncer, como para investigação de mecanismos de MDR.

Abstract: Cancer is one of the main public health problems in the world, being the second leading cause of death. Cancer treatment approaches include surgery resection, radiotherapy and pharmacological systemic therapy, as chemotherapy. However, multidrug resistance (MDR) is a problem of great importance in neoplastic treatment. The main mechanism of MDR involves an overexpression of ATP-binding cassette (ABC) transporters. ABC transporters carry out the efflux of drugs, decreasing their accumulation in resistant cells. Therefore, an investigation of changes in ABC expression levels as biomarkers of clinical MDR is relevant for predicting prognostic and therapeutic factors in cancer. However, the great challenge to perform an analysis of molecular samples is the low quantity and quality of RNA, DNA and isolated proteins. Furthermore, for handling small amounts of samples, such as tumor biopsies, a single extraction method is crucial to obtain macromolecules for further analysis. In this work, to overcome these limitations, a TRIzol-based method for simultaneous recovery of RNA, DNA and proteins from human cells and tissues was presented. The RNA yield depended on the nature of the sample, tissue or cell, but was 677 ng/mg tissue (n=51) or 4.6 µg/106 cells, with a 260/280 absorption ratio of 1.8-2.0. DNA and protein resulted in a mean yield of 225 ng/mg tissue and 2.7 µg/mg tissue, respectively. The results demonstrated that the method was efficiently used to detect genes encoding ABC transporters through RT-qPCR, genomic DNA and genotyping of TNFR1 rs767455, and proteins by gel electrophoresis and western blot, regardless the nature of the sample. Due to the ability of RNA, DNA and protein isolation from the same tissue sample, its low cost, high and quality of the macromolecules, this method will be advantageous in future studies of several cancer biomarkers, such as for investigation of MDR mechanisms.