Gene associado a patogenicidade em Colletotrichum abscissum e estudo da interação com o hospedeiro (Citrus sinensis)

Abstract

Resumo: A Podridão floral dos citros (PFC) é causada principalmente pelo fungo Colletotrichum abscissum. A capacidade de C. abscissum persistir nos pomares dificulta a sua eliminação através do uso de fungicidas, sendo seu controle possível apenas durante a florada e dependente do clima neste período. A identificação do ciclo de vida, ciclo nutricional e de genes associados com a interação patógeno-hospedeiro em C. abscissum é importante não apenas para o entendimento da doença, mas também para a identificação de novos alvos para o seu controle. Nesse sentido, o grupo de pesquisa Genética de Microrganismos da UFPR tem realizado estudos de genética funcional por meio de deleção de genes candidatos, obtenção e análise de bibliotecas de mutantes do fungo C. abscissum. Durante esse estudo foi obtido um mutante que perdeu a capacidade de causar a doença em flores de citros, entretanto, a inserção do cassete de deleção ocorreu de maneira ectópica, sendo desconhecida a localização do inserto. Dessa forma, o presente trabalho objetivou a identificação da região onde o cassete foi inserido no genoma do mutante IAC142EC utilizando a metodologia de Genome Walking. Ainda, foi realizado um estudo para avaliação do ciclo de vida e ciclo nutricional de C. abscissum em flores de citros e catafilo de cebola, a fim de contribuir para o entendimento dessa interação patógeno-hospedeiro. A metodologia de Genome Walking e análise genômica revelaram que a inserção ectópica no mutante IAC142EC ocorreu no gene BGL1, que codifica uma enzima da família Glycoside Hydrolase 3 (EC 3.2.1.-), provavelmente ?- Glucosidase (EC 3.2.1.21). Esta enzima atua na degradação da celobiose, um dissacarídeo resultante da degradação de celulose e que possui atividade inibitória das celulases. Esse dissacarídeo também atua como um indutor do sistema imune da planta (PTI) contra patógenos degradadores de parede. Assim, a deleção desse gene pode levar a perda da patogenicidade devido a ação do PTI e a incapacidade do patógeno degradar a parede celular vegetal, tal hipótese deverá ser comprovada por meio da deleção desse gene e avaliação fenotípica. Na análise microscópica dos processos de infecção e colonização de C. abscissum em flores de citros foi observada a formação de apressórios para penetração no tecido, a vesícula de infecção e na sequência o desenvolvimento das fases biotrófica e necrotrófica. Sugere-se assim para esta espécie o modo de vida hemibiotrófico, com uma curta fase biotrófica durante a colonização floral, seguida pela fase necrotrófica dominante.

Abstract: Postbloom Fruit Drop (PFD) disease is mainly caused by Colletotrichum abscissum. PFD is characterized by the presence of necrotic lesions on the petals, which lead to premature fruit drop. The ability of C. abscissum to persist in the orchards makes it difficult to eliminate it through the use of fungicides, and its control is possible only during flowering and depending on the climatic conditions. The identification of the lifestyle, nutritional cycle and genes associated to pathogen-host interaction in C. abscissum is important not only for the understanding of the disease, but also for the identification of new control targets. In this sense, the research group Genetics of Microorganisms of UFPR has carried out studies of functional genetics by deletion of candidate genes, obtaining and analyzing a collection of transformants of the fungus C. abscissum. During this study, an ectopic insertion transformant was non-pathogenic in citrus flowers, and the location of the cassette was unknown. Thus, the present work aimed to identify the region where the cassette was inserted into the genome of the mutant IAC142EC using the Genome Walking methodology. In addition, in order to contribute to the understanding of this pathogen-host interaction, a study was carried out to evaluate the lifestyle of C. abscissum in citrus flowers and epidermal onion layers. The Genome Walking methodology and the genomic analysis revealed that the insertion of the cassette into the IAC142EC mutant occurred in the BGL1 gene, which encodes an enzyme of Glycoside Hydrolase Family 3 (EC 3.2.1.-), probable the ?-Glucosidase enzyme (EC 3.2.1.21). This enzyme acts on the degradation of cellobiose, a disaccharide resulting from the degradation of cellulose and which has cellulase inhibitory activity. This disaccharide also acts as an inducer of the Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) against wall-degrading pathogens. Thus, deletion of this gene may lead to loss of pathogenicity due to the action of PTI and the inability of the pathogen to degrade the plant cell wall, this hypothesis should be confirmed by the deletion of this gene and phenotypic evaluation in citrus flowers. In the microscopic analysis of infection and colonization of citrus flowers by the fungus C. abscissum, there was the appresorium formation, tissue penetration, and development of the intracellular infection vesicle and, then, the biotrophic hyphae and, finally, switching to the necrotrophic phase. Thus, the hemibiotrophic lifestyle for this species is suggested, with a short biotrophic phase during floral colonization followed by the dominant necrotrophic phase.