Ação antimicrobiana e antibiofilme de metabólitos de fungos endofíticos isolados de Handroanthus chrysotrichus (Mart. Ex DC.) Mattos

Abstract

Resumo: A formação de biofilmes bacterianos representa um desafio significativo no campo da microbiologia e medicina, uma vez que essas estruturas complexas podem promover a resistência bacteriana a antibióticos e contribuir para a persistência de infecções. Neste contexto, a busca por novas estratégias terapêuticas tem levado à investigação de compostos naturais, como os metabólitos produzidos por fungos endofíticos. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito de compostos produzidos por fungos endofíticos para o controle da formação de biofilmes bacterianos em cateteres. Foram selecionados para o estudo, isolados oriundo de apêndices florais do Ipêamarelo (Handroanthus chrysotrichus Mart. EX DC).Mattos, denominados de F1, F22, F29, F34, F39 e F53. Para tanto, os metabólitos secundários produzidos pelos fungos endofíticos foram obtidos por fermentação em meio líquido, Batata Dextrose (BD) sendo fracionado em acetato de etila em funil de separação e foram testados quanto a capacidade de inibir o crescimento de bactérias formadoras de biofilme in vitro, bem como de impedir a formação de biofilmes na superfície de cateteres venosos centrais. Foram preparadas suspensões da bactéria Staphylococcus aureus ATCC6538 e avaliada em placas de 96 poços a concentração inibitória mínima (CIM) e também a menor concentração Bactericida. A partir da concentração resultante da CIM, suspensões bacterianas foram colocadas em contato com cateteres revestido com o metabólico fúngico com modificação de superfície utilizando sistema de varredura plasma jet. Após período de incubação de 5 dias a 37±2°C, foram avaliados se houve ou não a formação de biofilmes nas superfícies dos cateteres, em microscopia eletrônica de varredura (MEV), comparando aos tratamentos controle, sem metabólito fúngico, ou sem tratamento com plasma, ou ambos. Avaliou-se também a citotoxicidade dos endófitos baseado em utilização de macrófagos peritoneais murinos, no qual após análise, demostrou que o isolado F53 na concentração de 1mg/ml-1 não apresentou diferença estatística ao grupo controle, e os demais isolados obtiveram valores inferiores ao aceitável de =70% de células viáveis. Esta análise assim como resultado da CIM, resultou na escolha do isolado F53 para continuidade do estudo. Após avaliação da microscópica foi possível verificar diferenças na taxa de adesão celular e na formação de biofilmes nos cateteres tratados com metabólito do fungo endofítico F53, em ambas as faces dos cateteres. As observações dos tratamentos, permitiram avaliar o efeito sobre a colonização bacteriana, da modificação da superfície dos cateteres por jateamento de plasma, este por sua vez não tem em si ação antimicrobiana, no entanto a alteração da superfície resultou em uma taxa de adesão celular e de formação de colônias menores no tratamento com plasma em comparação ao tratamento com a superfície do cateter sem modificação. Por fim, os resultados obtidos neste estudo são promissores como indicativo para novos estudos, visando identificação das moléculas com ações biológicas com interesse biomédico, assim como para desenvolvimento futuro de produtos seguros para uso humano em ambientes hospitalares, visando o controle na formação de biofilmes em dispositivos médicos.

Abstract: The formation of bacterial biofilms represents a significant challenge in the field of microbiology and medicine, as these complex structures can promote bacterial resistance to antibiotics and contribute to the persistence of infections. In this context, the search for new therapeutic strategies has led to the investigation of natural compounds, such as the metabolites produced by endophytic fungi. Thus, the aim of this study was to evaluate the effect of compounds produced by endophytic fungi for controlling the formation of bacterial biofilms on catheters. Isolates derived from floral appendages of the Yellow Ipe (Handroanthus chrysotrichus Mart. EX DC) Mattos, named F1, F22, F29, F34, F39, and F53, were selected for the study. For this purpose, the secondary metabolites produced by the endophytic fungi were obtained through fermentation in liquid Potato Dextrose (PD) medium, fractionated in ethyl acetate using a separation funnel, and tested for their ability to inhibit the growth of biofilm-forming bacteria in vitro, as well as to prevent biofilm formation on the surface of central venous catheters. Suspensions of the bacterium Staphylococcus aureus ATCC6538 were prepared and tested in 96-well plates to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum bactericidal concentration. Based on the MIC concentration, bacterial suspensions were placed in contact with catheters coated with the fungal metabolite, with surface modification using a plasma jet scanning system. After a 5-day incubation period at 37±2°C, the formation of biofilms on the catheter surfaces was assessed using scanning electron microscopy (SEM), comparing the results with control treatments, either without fungal metabolite, without plasma treatment, or both. The cytotoxicity of the endophytes was also evaluated based on the use of murine peritoneal macrophages, showing that the F53 isolate at a concentration of 1mg/ml-1 had no statistically significant difference from the control group, while the other isolates showed values below the acceptable threshold of =70% viable cells. This analysis, along with the MIC results, led to the selection of the F53 isolate for further study. Microscopic evaluation revealed significant differences in cell adhesion rates and biofilm formation on catheters treated with the metabolite from the endophytic fungus F53, on both sides of the catheters. The treatment observations allowed the assessment of the effect on bacterial colonization of the surface modification of catheters by plasma jet treatment, which itself does not have antimicrobial action. However, surface modification resulted in lower rates of cell adhesion and colony formation in the plasma treatment compared to the treatment with unmodified catheter surfaces. Finally, the results obtained in this study are promising as indicators for further studies aimed at identifying molecules with biological activity of biomedical interest, as well as for the future development of safe products for human use in hospital settings, with the goal of controlling biofilm formation on medical devices.