Produção recombinante do precursor de ubiquitina UBB (tetra ubiquitina) e seu uso como substrato em ensaio de deubiquitinase

Abstract

Resumo : A ubiquitina é uma proteína de 76 aminoácidos que controla diversos processos celulares, sendo um dos mais relevantes a degradação de proteínas a partir do proteassoma 26S. Esta proteína é encontrada no organismo a partir de genes precursores, como o UBB. As enzimas deubiquitinases removem as cadeias de ubiquitina de proteínas e são classificadas em 7 diferentes famílias, sendo uma delas a família USP. A USP2a está envolvida em adenocarcinomas de próstata humana e há poucos inibidores disponíveis para essa enzima no mercado, o que limita a USP2a como alvo terapêutico. Além da própria USP2a purificada, a obtenção do substrato UBB é etapa fundamental no desenvolvimento de ensaios de deubiquitinase na aceleração das pesquisas para obtenção e caracterização de novos inibidores para a USP2a. Para a expressão recombinante de UBB, foi feito um ensaio de expressão em pequena escala do vetor pET24a-HsUB, seguido de uma avaliação com três meios diferentes: LB, ZYM e TB. Como resultado, mostrou-se mais adequada a condição de expressão em meio ZYM (pré-inóculo em LB), a qual foi empregada em etapas subsequentes em média escala (0,5 L). A purificação da UBB foi feita por cromatografia de afinidade a metal (Ni-NTA agarose), sendo que o rendimento total de proteína foi estimada em 1,1 mg/L e a pureza obtida para a UBB foi adequada para a utilização como substrato para o ensaio de deubiquitinase. O ensaio utilizando extratos de células superexpressando USP2a e USP2a recombinante evidenciou a atividade proteolítica da USP2a sobre UBB, sugerindo que a poli-ubiquitina pode ser usada em ensaio de deubiquitinase para identificar inibidores da USP2a