Estudo in vitro sobre o efeito do sulforafano em células endoteliais expostas a toxinas urêmicas

Abstract

Resumo: Pacientes com doença renal crônica (DRC) estão predispostos a complicações, como resultado da retenção patológica de toxinas urêmicas (TUs). Aproximadamente 50% dos pacientes com DRC nos últimos estágios morrem de doença cardiovascular (DCV). Na DRC, a exposição crônica do endotélio a TUs inicia os processos oxidativo e inflamatório na camada intima dos vasos sanguíneos. O sulforafano (SFN) é um isotiocianato derivado da glucorofanina, presente em vegetais crucíferos. Numerosas evidências sugerem que as propriedades benéficas do SFN ocorrem por meio da regulação positiva do fator nuclear relacionado ao eritroide 2 (Nrf2). O entendimento do mecanismo entre Nrf2 e o SFN e o seu papel na preservação do endotélio vascular são de grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Porém, não há dados que mostrem uma associação específica do SFN na DRC. Por isso, neste estudo avaliamos o efeito do SFN em células endoteliais humanas (HUVEC) tratadas com toxinas urêmicas. Soros humanos foram obtidos no Hospital Santa Casa de Curitiba, e caracterizados pools. Os tratamentos foram feitos com soro urêmico (SU), soro não urêmico (SNU), soro urêmico suplementado com toxina (SUTox) ou soro fetal bovino suplementado com toxina (SFBTox) nos tempos de 5, 24, 48 e 72 h. O estresse oxidativo foi quantificado pela determinação de carbonilas proteicas. A translocação nuclear de Nrf2 foi detectada por imunofluorescência. A expressão proteica de Nrf2 foi avaliada por western blotting. A expressão gênica de NFE2L2, TXN, GCLM, HMOX, NQO1; ICAM1 e TNFa foi analisada por RT-qPCR. O tratamento com SUTox aumentou significativamente a carbonilação e expressão proteica de Nrf2 em 72 h. O estresse oxidativo foi significativamente reduzido pelo SFN. Os resultados preliminares de expressão gênica indicam que o SFN aumentou a expressão de ICAM1 e dos genes alvo de Nrf2, e diminuiu a expressão de NFE2L2 e TNFa. Os dados de western blotting indicam que Nrf2 não está reprimido pela uremia nessa linhagem celular. Portanto, nossos dados mostram que o SFN diminui o estresse oxidativo induzido por toxinas urêmicas, porém, o aumento da expressão gênica de ICAM poderia limitar a função citoprotetora da ativação de Nrf2 pelo SFN, devido a consequências inflamatórias. Mais trabalhos são necessários para elucidar a relação entre o SFN na ativação de Nrf2 em células endoteliais.

Abstract: Patients with chronic kidney disease (CKD) are predisposed to stemming from pathological retention of uremic toxins (UTs). Approximately 50% of advanced CKD patients die from cardiovascular disease (CVD). In CKD, prolonged exposure of the endothelium to UTs initiates oxidative and inflammatory cascades in the intimal layer of blood vessels. Sulforaphane (SFN) is an isothiocyanate derived from glucoraphanin, found in cruciferous vegetables. Numerous pieces of evidence suggest that the beneficial properties of SFN occur through positive regulation of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2). Understanding the intricate mechanism between Nrf2 and SFN, and their role in preserving vascular endothelial function holds profound significance for the development of novel therapeutic modalities. However, there is no data establishing a specific association between SFN and CKD. Thus, this study aims to assess the effect of SFN on human endothelial cells (HUVEC) exposed to uremic toxins. Human sera were obtained from Hospital Santa Casa de Curitiba and characterized as pools. Treatments were conducted with uremic serum (SU), nonuremic serum (SNU), uremic serum supplemented with toxin (SUTox), or fetal bovine sera supplemented with toxin (SFBTox) at time points of 5, 24, 48, and 72 h. Oxidative stress quantification was executed by protein carbonyl determination. Nuclear translocation of Nrf2 was detected through immunofluorescence. Protein expression of Nrf2 was evaluated through western blotting. Gene expression of NFE2L2, TXN, GCLM, HMOX, NQO1, ICAM1, and TNFa was analyzed using RT-qPCR. Treatment with USTox significantly increased carbonylation and protein expression of Nrf2 at 72 h. Oxidative stress was significantly reduced by SFN. Preliminary findings indicated that SFN increased the gene expression of ICAM and Nrf2 target genes, while attenuating Nrf2 and TNFa expression. Western blotting data suggest that Nrf2 is not repressed in this cell lineage by uremia. Thus, our data indicate that SFN inhibits uremic toxins-induced oxidative stress, but the elevated ICAM gene expression may potentially delimit the cytoprotective capacity of Nrf2 activation by SFN due to inflammatory consequences. Further, comprehensive investigations are imperative to unravel the interrelationship among SFN, Nrf2 activation within endothelial cells.