Padronização de técnica de lise celular para obtenção de RNA total de diferentes tecidos

Abstract

Resumo: A medida que o conhecimento sobre uma variedade de doenças avança, tornou-se mais preciso as formas de prevenção, diagnóstico e tratamento. Os biomarcadores vêm sendo utilizados como ferramentas de auxílio na compreensão da predição, causa, diagnóstico, progressão, regressão ou resultado clínico de um tratamento ou doença. O rápido desenvolvimento das técnicas de biologia molecular ampliou a aplicabilidade dos biomarcadores. O câncer é uma das principais causas de morte em todo o mundo e a resistência à múltiplas drogas (MDR) é o maior desafio clínico para a eficácia do tratamento. Dentre os vários mecanismos de MDR, o aumento da expressão de transportadores ABC (ATP-binding cassette) é considerado o principal. Transportadores ABC têm um papel fisiológico no transporte de diversos compostos através da membrana plasmática às custas da ligação e hidrólise de ATP. O reconhecimento de compostos estruturalmente não relacionados como substratos permite que quimioterápicos também sejam transportados, o que leva à diminuição do acúmulo intracelular e consequentemente falha no tratamento quimioterápico em pacientes oncológicos. Portanto, é crucial identificar quais são os transportadores ABC superexpressos em diferentes tipos de câncer. Entretanto, existem vários desafios de padronizações de métodos e condições experimentais para determinar a expressão gênica em amostras clínicas. Por isso, o objetivo deste estudo foi a padronização de uma técnica de lise celular de diferentes tipos de tecidos para a extração de RNA total utilizando o TRIzol. Neste estudo foi desenvolvido um homogeneizador de baixo custo que eficientemente promoveu o rompimento de tecidos, possibilitando a obtenção de RNA total de alta qualidade e em grandes quantidades.

Abstract: The increased knowledge about a variety of diseases improved the prevention, diagnosis, and treatment. Biomarkers have been used as tools to improve the prediction, cause, diagnosis, progression, regression or clinical outcome of a treatment or disease. The rapid development of molecular biology techniques has expanded the applicability of these biomarkers. Cancer is one of the leading causes of death worldwide and multidrug resistance (MDR) is the most significant clinical challenge to treatment effectiveness. Among the various mechanisms of MDR, the increased expression of ABC transporters (ATP-Binding cassette) is considered critical. ABC transporters have a physiological role in the extrusion of various compounds across the plasma membrane. This efflux is mediated by the binding and ATP hydrolysis. The recognition of structurally unrelated compounds as substrates allows the transport of chemotherapeutics, which promote a significant decrease in the intracellular levels and consequently failure of clinical treatment of oncological patients. Therefore, it is crucial to identify which ABC transporters are overexpressed in different types of cancer. However, there are several challenges to the standardization of methods and experimental conditions to study the expression levels in clinical samples. Thus, the goal of this study was the standardization of a protocol of cell lysis for different types of tissues compatible with total RNA extraction using TRIzol. In this study, a low-cost homogenizer was developed that efficiently promoted tissue disruption, making it possible to obtain high quality total RNA in large quantities.