D-gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase de celulas HeLa : purificação, estudos cineticos e imunologicos

Abstract

Resumo: As gliceraldeído-3-fosfato desidrogenases(E.C.1.2.1.12) de fontes tumorais (células HeLa e tecido tumoral de mama) foram isoladas e purificadas, e suas propriedades cinéticas estudadas comparativamente às enzimas de outras fontes normais. As propriedades imunológicas da GPDH de células HeLa foram também estudadas. A pureza da GPDH de células HeLa foi mostrada por eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS, apresentando uma única banda correspondente à subunidade com PM de 36.000. 0 pH ótimo encontrado para ambas as enzimas foi de 8,2. Os valores de Km para a GPDH de células HeLa foram determinados parado gliceraldeído-3- fosfato e para o NAD+ sendo em torno de 1,0 x 10 M e 3,07 x 1 0 ~^M, respectivamente. Para a GPDH de tecido tumoral de mama, os valores de Km para o gliçeraldeído-3-fosfato e o NAD foram de 8,26 x 10 M e 1,53 x 10 M, respectivamente. Foi demonstrado que o I||ADH é um inibidor competitivo em relação as NAD , sendo oKide3,25xio H e 5,35 x 10 M, respectivamente para as GPDHs de células HeLa e de tecido tumoral de mama. 0 ATP também foi demonstrado ser um inibidor competitivo em relação ao NAD* sendo o Ki de 2,61 x 10 M para a GPDH de células HeLa. A imunoeletroforese do antígeno (GPDH de células HeLa) apresentou uma única banda de precipitina com sua respectiva imunoglobulina, demonstrando a pureza de preparação da GPDH desta fonte. A imunoeletroforese do anticorpo anti-GPDH de células HeLa mostrou 3 bandas de precipitina, com o < ^ respectivo antígeno provavelmente correspondentes aos tres tipos mais comuns de imunoglobulinas (IgG, IgM, IgA). Quando testada frente aos anticorpos anti-GPDH de músculo deAnas sp. (pato), a GPDH de células HeLa apresentou determinantes imunologicamente idênticos ao dos antígenos de músculo de Caiman sp. (jacaré) e tumor de mama humano, mas apenas alguns determinantes antigênicos imunologicamente idênticos em relação ao antígeno de músculo de Anas sp.. Quando testada frente aos anticorpos anti-GPDH de células HeLa, a GPDH destas células apresentou os determinantes antigênicos imunologicamente idênticos aos antígenos de Caiman sp. e de tumor de mama humano. Não houve porém, formação de banda de precipitina frente ao antígeno de músculo de Anas sp., indicando que o grupo determinante correspondente provavelmente foi modificado ou perdido. As GPDHs de células HeLa e de tecido tumoral de mama humano não demonstraram diferenças físico-químicas significativas em relação às GPDHs de outras fontes já estudadas.