Expressão e caracterização dos dominios central+C- terminal da proteina NIFA de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo: A proteína NifA é responsável pela ativação da transcrição dos operons nif em diazotrofos. Neste trabalho são apresentados resultados referentes a expressão e caracterização in vivo e in vitro dos domínios Central e C-terminal da proteína NifA H. seropedicae. Para a produção da proteína, dois sistemas foram utilizados: a expressão como proteína de fusão a glutationa S-transferase ou a um polipeptídeo contendo histidinas (His-Tag). A expressão da proteína de fusão GST-Central+C-terminal foi elevada, porém apresentou-se de forma insolúvel. Após processo de desnaturação e renaturação, a proteína foi purificada por cromatografia de afinidade e testada quanto a sua capacidade de ligação ao DNA, apresentando um resultado negativo. A proteína também foi utilizada para a produção de anticorpos policlonais. Testes de "immunoblot" indicaram que os anticorpos reconhecem a proteína NifA nativa e seus domínios Central e C-terminal, não reconhecendo a proteína homóloga de K. pneumoniae ou a glutationa S-transferase. A proteína de fusão His-Tag Central+C-terminal também apresentou um elevado grau de expressão e mostrou-se parcialmente solúvel. Após cromatografia por afinidade, a proteína foi capaz de ligar-se a região promotora do gene nifB de H. seropedicae de forma específica. Ensaios in vivo em E. coli, utilizando fusões nifH::lacZ, mostraram que a proteína é capaz de ativar a transcrição na ausência de O2 e independente da concentração de íons NH4+ . NifA íntegra, expressa e analisada nas mesmas condições, não mostrou capacidade de ativar a transcrição indicando a ausência de uma proteína reguladora para a sua atividade em E. coli.