Caracterização do perfil secretório de exossomos mediado pela via PI3K/AKT/mTOR em linhagem de carcinoma de células escamosas bucal

Abstract

Resumo: O carcinoma de células escamosas bucal é o câncer mais frequente dentro dos carcinomas de cabeça e pescoço, e de baixa taxa de sobrevida quando ocorrem metástases. Exossomos, vesículas extracelulares de origem endocítica, são liberados por uma variedade de células para o espaço extracelular, fazem parte da comunicação célula-célula e vem sendo cada vez mais estudados para avaliação terapêutica em algumas doenças, principalmente no câncer. Quando os exossomos oriundos de células tumorais interagem com o tecido estromal circundante podem ativar vias proliferativas e angiogênicas, dando início a um nicho prémetastático. Fármacos que atuam diretamente em PI3K, AKT e mTOR vem sendo estudados como uma terapia conjunta à radioterapia no tratamento antineoplásico, uma vez que essa via se mostra presente pela ativação aberrante do oncogene PI3KCA. O objetivo deste estudo in vitro foi avaliar o perfil secretório de vesículas extracelulares em linhagem de carcinoma de células escamosas bucal e a contribuição da via PI3K/AKT/mTOR para esse processo. Células SCC-9 foram tratadas com inibidores farmacológicos que atuam em PI3K (LY294002)/AKT(Triciribina)/mTOR(AZD 2014), sendo isoladas as vesículas extracelulares através de centrifugação e ultracentrifugação, análise pelo microscópio Nanosight, caracterizando as microvesículas e exossomos dos diferentes tratamentos, e avaliação a proliferação e modulação da atividade metabólica com a exposição com as vesículas extracelulares. Os resultados obtidos permitiram a identificação de dois grupos de vesículas extracelulares secretadas por células SCC-9, as chamadas microvesiculas, que apresentam de 100nm a 1µm, e os exossomos, de 30-160nm, sendo que as microvesículas foram detectadas em maior proporção em comparação com exossomos. Em relação ao tratamento com os inibidores, não foi observado alteração estatisticamente significante do perfil secretório de microvesículas de células SCC-9 (p=0.1997) após o uso dos diferentes fármacos. De forma interessante, o inibidor de PI3K reduziu a concentração de exossomos detectada no meio de cultura (p=0.0348) quando comparado a condição controle (células tratadas com o veículo DMSO). Resultados preliminares sugerem ainda que exossomos derivados das células controle (células mantidas em meio ou mantidas somente com o veículo DMSO) promovem um aumento da capacidade proliferativa de células SSC-9. Porém, quando os exossomos foram derivados de células tratadas com os fármacos, o efeito na proliferação foi diminuído, em especial para o fármaco inibidor de PI3K. Em conclusão, o tratamento com os inibidores de PI3K/AKT/mTOR foi observado uma redução na proliferação celular com o inibidor de PI3K, além de reduzir a secreção de exossomos liberados por células de carcinoma de células escamosas bucais, porém sem alteração para a liberação de microvesículas. Os exossomos oriundos dos tratamentos com os inibidores conseguiram reduzir o efeito proliferativo celular em 72h, especialmente o inibidor de PI3K, o que nos sugere representar uma opção terapêutica adjuvante nas terapias antineoplásicas do câncer de boca.

Abstract: Oral squamous cell carcinoma is the most common cancer among head and neck carcinomas and has a low survival rate when metastases occur. Exosomes, extracellular vesicles of endocytic origin, are released by a variety of cells into the extracellular space, are part of cellcell communication and have been increasingly studied for therapeutic evaluation in some diseases, especially cancer. When exosomes from tumor cells interact with the surrounding stromal tissue, they can activate proliferative and angiogenic pathways, initiating a premetastatic niche. Drugs that act directly on PI3K, AKT and mTOR have been studied as a joint therapy with radiotherapy in antineoplastic treatment, since this pathway is present due to the aberrant activation of the PI3KCA oncogene. The aim of this in vitro study was to evaluate the secretory profile of extracellular vesicles in oral squamous cell carcinoma cell lines and the contribution of the PI3K/AKT/mTOR pathway to this process. SCC-9 cells were treated with pharmacological inhibitors that act on PI3K (LY294002)/AKT(Triciribine)/mTOR(AZD 2014), and the extracellular vesicles were isolated by centrifugation and ultracentrifugation, analyzed using a Nanosight microscope, characterizing the microvesicles and exosomes of the different treatments, and assessing proliferation and modulation of metabolic activity with exposure to the extracellular vesicles. The results obtained allowed for the identification of two groups of extracellular vesicles secreted by SCC-9 cells, the so-called microvesicles, which range from 100nm to 1µm, and exosomes, from 30-160nm, with microvesicles being detected in greater proportion compared to exosomes. In relation to treatment with the inhibitors, there was no statistically significant change in the secretory profile of microvesicles in SCC-9 cells (p=0.1997) after using the different drugs. Interestingly, the PI3K inhibitor reduced the concentration of exosomes detected in the culture medium (p=0.0348) when compared to the control condition (cells treated with the DMSO vehicle). Preliminary results also suggest that exosomes derived from control cells (cells maintained in medium or maintained only with the DMSO vehicle) promote an increase in the proliferative capacity of SSC-9 cells. However, when the exosomes were derived from cells treated with the drugs, the effect on proliferation was reduced, especially for the PI3K inhibitor drug. In conclusion, treatment with PI3K/AKT/mTOR inhibitors was observed to reduce cell proliferation with the PI3K inhibitor, in addition to reducing the secretion of exosomes released by oral squamous cell carcinoma cells, but without altering the release of microvesicles. The exosomes from the treatments with the inhibitors were able to reduce the cell proliferative effect in 72 hours, especially the PI3K inhibitor, which suggests that they represent an adjuvant therapeutic option in antineoplastic therapies for oral cancer.