RNAs longos não codificadores em vesículas extracelulares de mulheres com lesões pré-cancerosas do colo do útero e câncer cervical

Abstract

Resumo : A infecção persistente pelo HPV na região da endocérvix pode progredir para lesões intraepiteliais escamosas (LIE) consideradas pré-malignas, que podem ser subdivididas em lesões de baixo grau (LIEBG) e lesões de alto grau (LIEAG). Devese considerar que o diagnóstico precoce das lesões pode evitar o progresso da mesma para o estágio de câncer cervical. Neste contexto, sabe-se que vesículas extracelulares (VEs) isoladas de vários fluídos biológicos podem carrear em seu interior RNAs não codificantes, como por exemplo, microRNAs e lncRNAs, capazes de alterar o fenótipo de células aceptoras, e, portanto, disseminar o fenótipo précancerígeno ou cancerígeno e modular o microambiente pré-tumoral. Os lncRNAs HOTAIR e PVT1 já foram previamente associados por expressão diferencial à progressão do câncer cervical. Portanto, o objetivo deste trabalho, foi quantificar e verificar se há diferenças de expressão de HOTAIR e PVT1 extraídos de VEs circulantes em plasma sanguíneo de 10 mulheres com LIEBG, 11 mulheres com LIEAG, três mulheres com câncer cervical e de nove mulheres saudáveis. As VEs foram isoladas por precipitação com kit comercial e caracterizadas por rastreamento de nanopartículas (NTA), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e Western Blotting (WB). Foi estabelecido um protocolo de isolamento de RNA total das vesículas que permite separação por tamanho (microRNAs e lncRNAs). A quantificação dos lncRNAs foi feita por RT-PCR em tempo real. Não houve diferença estatisticamente significativa de tamanho (p=0,6286) e de concentração (p=0,6286) entre vesículas isoladas de plasma de controles e de pacientes com diferentes com lesões. Em fotomicrografias de MET, foi possível a visualização de vesículas majoritariamente de tamanho entre 100 e 200 nm. Através da técnica de WB, foi possível a detecção de proteínas características de vesículas nas partículas isoladas, tais como CD9 e CD63. Não houve diferença estatisticamente significativa de expressão do HOTAIR entre pacientes com algum tipo de lesão e controles (p=0,1348); em pacientes com câncer cervical em relação a controles (p=0,6667), bem como em todas as demais comparações realizadas. O lncRNA PVT1 somente foi detectado em vesículas isoladas de plasma de uma paciente com câncer cervical. Os resultados até o momento corroboram estudos anteriores, os quais demonstram que ambos os transcritos, HOTAIR e PVT1, podem ser mais relevantes localmente na progressão tumoral cervical e que o último atua em nível sistêmico majoritariamente livre no sangue