Validação funcional do SNP rs10900596 do gene MDM4 associado ao risco de câncer de mama

Abstract

Resumo : MicroRNAs (miRNAs) são reguladores pós-transcricionais que tem como alvo um ou mais RNAm, normalmente inibindo a síntese proteica. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) localizados na posição 3'UTR, região em que miRNAs tipicamente se ligam, podem alterar a afinidade de miRNAs com seu RNAm-alvo e interferir na sua expressão. Em estudo in silico realizado pelo nosso grupo de pesquisa, foi utilizada uma abordagem estatística Bayesiana Ingênua para integrar os dados dos algoritmos PolyMirts, MirSNP e mirSNP score, os quais predizem os efeitos de SNPs no sítio de interação com miRNAs. Seguiu-se com a integração dos dados obtidos nos estudos de associação genômica (GWAS-Genome Wide Association Studies) e dos dados de expressão de loci de características quantitativas (eQTLs-Quantitative Trait Loci) específicos para o câncer de mama e que permitiram a predição de miRNAs que poderiam estar relacionados ao câncer de mama de modo SNP-dependente. Com a análise dos dados obtidos, o presente estudo visa validar se o SNP predito como de risco ao câncer de mama (rs10900596 T>C) afeta o sítio de interação do miR-1257 em 3’UTR do RNAm do gene MDM4 nas linhagens tumorais de câncer de mama MDA-MB-231 e ZR-75-1. Após a genotipagem dessas linhagens através do sequenciamento de Sanger, a região contendo as variantes do SNP de interesse foi amplificada utilizando os iniciadores desenhados pelo autor. Para clonagem da região 3'UTR do gene MDM4 no vetor pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector (Promega) empregou-se as enzimas de restrição NheI e SalI (Thermo Scientific) e para realizar a ligação do inserto no vetor foi usada a enzima T4 DNA Ligase (Thermo Scientific). Aplicando a abordagem de stem-loop RT primer foram desenhados iniciadores para transcrição reversa do miR-1257 e detecção dos RNAs endógenos. A partir do RNA extraído das linhagens tumorais de mama MCF-7, ZR-75-1 e MDA-MB-231 foram sintetizados cDNA obtidos por transcrição reversa para serem utilizados na quantificação do micro-RNA alvo deste estudo empregando os primers específicos para qRT-PCR (PCR quantitativa em tempo real). Os resultados obtidos trazem otimizações de passos importantes que precedem a validação do SNP, como a obtenção de grande quantidade de DNA purificado para utilização na clonagem e a própria metodologia empregada em cada etapa para a obtenção dos clones. Este trabalho possibilitou o direcionamento adequado da utilização das linhagens de câncer de mama com as genotipagens corretas frente ao SNP rs10900596