Engenharia metabólica de Escherichia coli para a produção de ácido delta-aminolevulínico

Abstract

Resumo: O ácido delta-aminolevulínico (ALA) é um delta aminoácido de ampla ocorrência, encontrado em animais, vegetais e bactérias. As vias descritas de síntese química de ALA possuem muitas etapas e são custosas, fazendo-se necessária a busca por novas formas mais econômicas, simples e ecológicas para a sua produção. Escherichia coli desponta como microrganismo de interesse para a produção de ALA devido ao vasto conhecimento acerca do seu metabolismo, das ferramentas de manipulação genética já aprimoradas e de suas conhecidas condições de cultivo. Este trabalho buscou desenvolver estirpes de E. coli que produzam ALA a partir de um meio de baixo custo utilizando o plasmídeo pTHR, um vetor contendo os genes hemA e rhtA com a expressão controlada pelo promotor Ptac, um promotor sintético produzido da combinação dos promotores naturais dos operons lac e trp em E. coli. Cinco estirpes de E. coli foram transformadas com pTHR: MG1655, TOP10, BL21(DE3), BW25113 e W3110. O efeito da expressão do operon Ptac_hemA_rhtA no crescimento e na produção de ALA das diferentes estirpes foi analisado. A suplementação de meio mínimo com D-glucose e L-glicina (MMALA) apontou um aumento de 514,1% na produção de ALA por TOP10_pTHR em relação ao meio com suplementação apenas de D-glucose, indicando que a L-glicina é um componente chave para a produção de ALA em estirpes portando pTHR. A estirpe BL21(DE3)_pTHR apresentou a maior produção de ALA (1,065 g/L) em meio MMALA após 48 horas de cultivo. Seu crescimento, produção de ALA e consumo de glucose foram monitorados durante 20 horas consecutivas para caracterização da estirpe. A perspectiva é que a produção de ALA por BL21(DE3)_pTHR seja maior em cultivos realizados em biorreatores contendo meio complexo suplementado com glucose, succinato e glicina. Espera-se que cultivos de BL21(DE3)_pTHR possam ser utilizados no desenvolvimento de produtos alimentícios e rações animais suplementadas.

Abstract: delta-aminolevulinic acid (ALA) is a widely occurring delta amino acid found in animal, plant and bacterial cells. The described routes of chemical synthesis of ALA have many steps and are costly, making it necessary to search for new, more economical, simple and ecological ways to produce ALA. E. coli emerges as a microorganism of interest for producing ALA due to its vast knowledge about its metabolism, already improved synthetic biology tools and known cultivation conditions. This work sought to develop E. coli strains that produce ALA from a low-cost medium using the pTHR plasmid, a vector containing the Ptac-controlled hemA and rhtA genes. Five E. coli strains were transformed with pTHR: MG1655, TOP10, BL21(DE3), BW25113 and W3110. The effect of Ptac_hemA_rhtA operon expression on growth and ALA production of different strains was analysed. Minimal medium supplementation with glucose and glycine (MMALA) achieved a 514.1% increase in ALA production by TOP10_pTHR relative to medium supplemented with glucose alone, indicating glycine as a relevant nutrient for ALA production in strains carrying pTHR. The BL21(DE3)_pTHR strain showed the highest ALA production (1,065 g/L) in the MMALA medium after 48 hours of cultivation. Its growth, ALA production and glucose consumption were monitored for 20 consecutive hours for strain characterization. The perspective is that the production of ALA by BL21(DE3)_pTHR is greater in cultures carried out in bioreactors containing complex medium supplemented with glucose, succinate and glycine. It is expected that BL21(DE3)_pTHR cultures can be used in the development of food products and supplemented animal feeds.