Desenvolvimento e validação de método por CLAE-EM/EM para quantificação de sitagliptina em plasma humano

Abstract

Resumo: A terapia medicamentosa deve ser considerada para pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (DM2) que não alcançam o controle glicêmico mesmo após a alteração no estilo de vida. Dentre as opções disponíveis destaca-se o fosfato monohidratado de sitagliptina (STG). A adesão terapêutica do paciente é fundamental para sua qualidade de vida. Uma das alternativas para aumentar a adesão ao tratamento, é adaptar as formulações existentes. O desenvolvimento de uma nova forma farmacêutica contendo STG pode alterar suas características farmacocinéticas, fazendo-se necessário o estudo comparativo entre as formulações. Para este fim, é necessário que a metodologia bioanalítica seja capaz de quantificar o STG em intervalos de concentração plasmática adequadas. Assim, o presente estudo teve como objetivo desenvolver, validar e aplicar um método por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas (CLAE - EM/EM) para a quantificação do STG em plasma humano. As análises foram realizadas utilizando o sistema CLAE Agilent 1200, acoplado ao espectrômetro de massas Triplo Quadrupolo Applied Biosystems API 3200, com fonte de ionização electrospray, operando no modo positivo de ionização. Após o desenvolvimento, o método foi validado de acordo com as normativas nacional e internacional vigentes. O método foi realizado em coluna Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 x 50 mm, 3,5 µm) acoplada a uma pré-coluna Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 x 12,5 mm, 5 µm), mantidas a 35 ºC. A fase móvel consistiu em água e acetonitrila, ambas contendo 0,1% de ácido fórmico, com eluição gradiente. O fluxo foi mantido em 0,3 mL/min. O volume de injeção foi de 20 µL. O método desenvolvido mostrou-se seletivo, livre de efeito residual e de matriz. O baixo limite de quantificação indicou que o método é sensível (LIQ = 1,5 ng/mL). As curvas de calibração apresentaram uma correlação (r >= 0,99) nas faixas de 1,5 a 500 ng/mL para a sitagliptina. O método foi preciso (CV < 13,1%) e exato (EPR < 11,8%). A recuperação da sitagliptina e do padrão interno (fluconazol) > 90%. A estabilidade dos analitos foi observada tanto em plasma quanto em solução. A aplicabilidade do método foi demonstrada por meio de um estudo farmacocinético parcial, entre duas formulações contendo sitagliptina, sendo adequado ao objetivo proposto.

Abstract: Drug therapy should be considered for patients with type 2 diabetes mellitus (DM2) who do not achieve glycemic control even after changes in lifestyle. Among the options available, sitagliptin phosphate monohydrate (STG) stands out. The patient's therapeutic adherence is fundamental to his quality of life. One of the alternatives to increase adherence to treatment is to adapt existing formulations. The development of a new pharmaceutical form containing STG can alter its pharmacokinetic characteristics, making a comparative study between formulations necessary. For this purpose, it is necessary that the bioanalytical methodology is able to quantify the STG in appropriate plasma concentration ranges. Thus, the present study aimed to develop, validate and apply a high performance liquid chromatography method coupled to mass spectrometry (HPLC-EM/EM) for the quantification of STG in human plasma. The analyzes were performed using the CLAE Agilent 1200 system, coupled to the Applied Biosystems API 3200 Triple Quadrupole mass spectrometer, with electrospray ionization source, operating in the positive ionization mode. After development, the method was validated according to the national and international regulations in force. The method was performed on a Zorbax Eclipse Plus C18 column (2.1 x 50 mm, 3.5 µm) coupled to a Zorbax Eclipse Plus C18 column (2.1 x 12.5 mm, 5 µm), maintained at 35 ºC. The mobile phase consisted of water and acetonitrile, both containing 0.1% formic acid, with gradient elution. The flow was maintained at 0.3 ml/min. The injection volume was 20 µL. The method developed was selective, free of residual and matrix effects. The low limit of quantification indicated that the method is sensitive (LLQ = 1.5 ng/mL). The calibration curves showed a correlation (r >= 0.99) in the 1.5 to 500 ng / mL ranges for sitagliptin. The method was precise (CV < 13.1%) and accurate (SE < 11.8%). Recovery of sitagliptin and internal pattern (fluconazole) > 90%. Analyte stability was observed in both plasma and solution. The applicability of the method was demonstrated by means of a partial pharmacokinetic study, between two formulations containing sitagliptin, being adequate to the proposed objective.