Análise genética e funcional dos genes nifENXorf1orf2, nifQmodABCfixXC de Herbaspirillum seropedicae

Abstract

Resumo: Os genes a jusante dos genes nifHDK de H. seropedicae foram isolados de um banco genômico construído no vetor EMBL3 (MACHADO et al., 1996) com uma sonda de DNA contendo os genes nifDK de H. seropedicae. Um bacteriófago recombinante denominado GK10, foi isolado e fragmentos de DNA subdonados foram sequenciados. A jusante dos genes nifHDK um fragmento de DNA Sall-EcoRI de 1,2 kb continha a região 3' do gene nifK e a região 5' do gene nifE. A região intergênica não contém sequência homóloga à sequência consenso de promotores nif ou de qualquer outro promotor conhecido. Um fragmento contíguo ao anterior EcoRI de 4,0 kb contém a região 3' do gene nifE e os genes nifNXorf1orf2. Nenhuma atividade de promotor foi identificada em toda região sequenciada. Estudos de complementação e fusão lacZ sugerem que os genes nifHDKENXorflorf2 constituem um único operon regulado por oxigênio e amônia sob o controle do promotor do gene nifH. Mutagênese nos genes nifN, nifX e orf1 mostraram que o gene nifN é essencial para fixação de nitrogênio em H. seropedicae. Similarmente os genes nifX e orf1 se revelaram essenciais para atividade da nitrogenase em condições limitantes de ferro. Um fragmento EcoRl-Sall de 3,7 kb localizado à aproximadamente 3 kb desta região foi isolado, sequenciado e revelou a presença dos genes nifQmodABCfixXC. Mutantes por inserção nos genes nifQ e modA foram obtidos e apresentaram deficiência em fixação de nitrogênio sob condições limitantes de molibdênio. Estes mutantes foram também deficientes para crescimento dependente de nitrato, provavelmente devido a baixa atividade da molibdoenzima nitrato redutase.

Abstract: A EMBL3 genomic library of H. seropedicae was screened to isolate the genes downstream from nifHDK by plate hybridization with a 2 kb Sa/I fragment containing the nifDK genes of H. seropedicae as a probe. A recombinant phage, A.GK10, was isolated and sequenced and the 3'-region of the nifK gene and the 5'-region of the nifE genes were identified in a 1.2 kb Sall/EcoRl DNA fragment. The intergenic region did not reveal any sequence homologous to a nif promoter consensus sequence nor to any other known promoter. A lacZ fusion was inactive, confirming the absence of an active promotor in the nifK-nifE intergenic region. In a contiguous 4.0 kb EcoRI DNA fragment we found the 3'-region of the nifE gene and the nifNXorf1orf2 genes. No typical promoter was found in the sequenced region and complementation and lacZ fusion studies indicated that the nifHDKENXorf1orf2 genes constituted a single operon regulated by 0 2 and NH4+. Insertional mutagenesis in nifN, nifX and orfl showed that nifN is essential for nitrogen fixation in H. seropedicae but nifX, orf1 and orf2 were not. However, the nifX and orf1 genes were found to be essential for nitrogenase activity under conditions of iron limitation. In a 3.7 kb EcoRl-Sall DNA fragment located 3.0 kb downstream from this region we found the genes nifQmodABCfixXC. Insertional mutants in the nifQ and modA genes were obtained and were deficient in nitrogen fixation under low molybdenum conditions. These mutants were also deficient in nitratedependent growth, probably due to low activity of the molybdoenzyme nitrate reductase. In sumary, this work has identified and sequenced 13 open reading frames associates with nif genes in H. seropedicae and indicated, by site mutagenesis and physiological studies, the conditions in which these genes are essential for nitrogen fixation.