Diagnóstico molecular de Toxoplasma gondii e monitoramento de Neospora caninum no leite cru de vacas naturalmente infectadas

Abstract

Resumo: Estudos sobre a detecção de Toxoplasma gondii e Neospora caninum no leite de vaca são escassos e ainda existem lacunas no conhecimento sobre alguns aspectos da epidemiologia e diagnóstico desses protozoários. A presente tese está dividida em uma revisão de literatura e em quatro capítulos. O capítulo I compara os métodos sorológicos Reação de Imunofluorescência indireta (RIFI) e Ensaio de Imunoabsorção Enzimática Indireto (ELISA) para a detecção de anticorpos anti-N. caninum em vacas leiteiras. Das 106 amostras de sangue coletadas, a prevalência de anticorpos foi de 24,5% na RIFI e 27,3% no ELISA e de 15% em ambos os testes. A concordância entre as técnicas foi moderada. Foram observadas divergências principalmente em níveis mais baixos de anticorpos e a concordância foi maior no ponto de corte de 1:100. O capítulo II teve como objetivos detectar o DNA de T. gondii em amostras de leite cru e avaliar a ocorrência de anticorpos anti-T.gondii em vacas leiteiras de seis pequenas propriedades do sul do Brasil. Foram coletadas amostras pareadas de sangue e leite de 106 vacas e amostras de leite dos tanques foram coletadas de cada propriedade. A ocorrência de anticorpos anti-T.gondii pela RIFI foi de 14,1%. O DNA de T. gondii foi detectado pela nested PCR e os produtos confirmados por sequenciamento de Sanger em 2,8% das amostras de leite. Não foi detectado DNA em nenhuma amostra de leite dos tanques. O capítulo III objetivou padronizar e validar um ensaio de PCR em tempo real baseado em SYBR Green para detectar o segmento Nc5 do genoma de N.caninum. Foi selecionado o conjunto de primers NP7/NP10 e as condições de reação foram otimizadas. A análise da curva padrão estabeleceu uma eficiência de reação de 102,34%, um coeficiente de correlação (R2) de 0,999 e slope de -3.267. O limite de detecção (LOD) foi de 0,456 taquizoítos por reação. O ensaio de PCR em tempo real foi 100 vezes mais sensível que a PCR convencional. A análise de precisão demonstrou 100% de repetibilidade intra e inter-ensaio nas diluições 1-10- 4 O ensaio exibiu alta especificidade pela análise da curva de dissociação e não foram observadas reações cruzadas com outros microrganismos. O ensaio foi aplicável à detecção de N. caninum em diferentes matrizes, incluindo o leite. O capítulo IV objetivou detectar o DNA de N. caninum em amostras de leite cru, monitorar a cinética de anticorpos séricos e a eliminação do protozoário no leite de vacas naturalmente infectadas. Amostras pareadas de sangue e leite de 12 vacas em lactação foram coletadas quinzenalmente por três meses. Neospora caninum foi detectado em 31,9% das amostras de leite testadas pela PCR em tempo real. Nenhuma amostra de leite foi positiva na PCR convencional. A eliminação do protozoário foi intermitente. Os níveis de anticorpos IgG detectados pela RIFI e o ELISA no soro flutuaram ao longo do tempo, mas não estiveram relacionados com a eliminação do protozoário no leite. Testes moleculares no leite podem ser ferramenta útil para a melhor compreensão da epidemiologia da toxoplasmose e da neosporose.

Abstract: Studies on the detection of Toxoplasma gondii and Neospora caninum in cow's milk are scarce and there are still gaps in knowledge about some aspects of the epidemiology and diagnosis of these protozoa. This thesis is divided into a literature review and four chapters. Chapter I compares the serological methods Indirect Fluorescent Antibody Test (IFAT) and Indirect Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) for the detection of anti-N. caninum antibodies in dairy cows. From 106 blood samples collected, the prevalence of antibodies was 24.5% in the IFAT and 27.3% in the ELISA, and 15% in both tests. The agreement between the techniques was moderate. Differences were observed mainly at lower levels of antibodies and agreement was higher at the cutoff point of 1:100. Chapter II aimed to detect T. gondii DNA in raw milk samples and to evaluate the occurrence of anti-T. gondii antibodies in dairy cows from six small farms in southern Brazil. Paired blood and milk samples were collected from 106 cows, and bulk-tank milk samples were collected from each farm. The occurrence of anti-T. gondii antibodies by IFAT was 14.1%. T. gondii DNA was detected by nested PCR and the products confirmed by Sanger sequencing in 2.8% of the milk samples. No DNA was detected in any milk sample from the bulktank. Chapter III aimed to standardize and validate a SYBR Green-based real-time PCR assay to detect the Nc5 segment of the N. caninum genome. The NP7/NP10 primer set was selected and reaction conditions were optimized. Standard curve analysis established a reaction efficiency of 102.34%, a correlation coefficient (R2) of 0.999 and slope of -3.267. The limit of detection (LOD) was 0.456 tachyzoites per reaction. The real-time PCR assay was 100 times more sensitive than conventional PCR. Precision analysis demonstrated 100% intra- and inter-assay repeatability at dilutions 1-10-4 The assay exhibited high specificity by dissociation curve analysis and no cross-reactions with other microorganisms were observed. The assay was applicable for detection of N. caninum in different matrices, including milk. Chapter IV aimed to detect N. caninum DNA in raw milk samples, monitor serum antibody kinetics and protozoan shed in milk from naturally infected cows. Paired blood and milk samples from 12 lactating cows were collected every other week for three months. Neospora caninum was detected in 31.9% of the milk samples tested by real-time PCR. No milk samples were positive by conventional PCR. The excretion of the protozoan was intermittent. IgG antibody levels detected by IFAT and ELISA in serum fluctuated over time, but were not related to shed of the protozoan in milk. Molecular testing of milk may be a useful tool for better understanding the epidemiology of toxoplasmosis and neosporosis.