The role of NLRP3 inflammasome activation in the epithelial to mesenchymal transition process during the fibrotic process
Resumo
Resumo: A fibrose é considerada uma forma complexa de dano tecidual comumente presente em o estágio final de muitas doenças. Também está relacionado a uma alta porcentagem de morte, cujas características predominantes são uma deposição excessiva e anormal de fibroblastos e componentes da matriz extracelular (MEC) derivados de miofibroblastos. A transição epitelial para mesenquimal (EMT), um processo no qual as células epiteliais mudam gradualmente para as mesenquimais, é um dos principais contribuintes na patogênese da fibrose. O mediador principal da EMT é uma citocina multifuncional chamada fator de crescimento transformador-B (TGF-B) que atua como o principal indutor da montagem e remodelação da ECM por meio da fosforilação de Smad2 / 3, que, em última análise, forma um complexo com Smad4 e se transloca em O núcleo. Por outro lado, a proteína-7 morfogênica óssea (BMP-7), um membro da família TGF, reverte a EMT ao neutralizar diretamente a sinalização celular dependente de Smad induzida por TGF-B. O NLRP3 (proteína 3 contendo domínios NACHT, LRR e PYD), por sua vez, atua como sensores citosólicos de moléculas microbianas e auto-derivadas e forma um complexo imunológico denominado inflamassoma no contexto de comprometimentos inflamatórios. A montagem do inflamassoma NLRP3 é desencadeada por ATP extracelular, espécies reativas de oxigênio (ROS), efluxo de potássio, desequilíbrio de cálcio e ruptura de lisossoma. Devido ao seu envolvimento em várias doenças, o NLRP3 tornou-se um dos receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) mais estudados. No entanto, o papel do NLRP3 no desenvolvimento da fibrose não foi completamente elucidado. Nosso objetivo nesta pesquisa foi estudar a formação do complexo inflamassoma após a indução de EMT por TGF-B em células epiteliais tubulares renais humanas e murinas. Para tanto, tentamos transfectar as células epiteliais tubulares humanas HK-2 e as murinas mm55.k com proteínas inflamatórias NLRP3 e ASC marcadas com GFP e Cerulean, respectivamente. A fim de investigar o processo EMT, tanto E-caderina quanto ?-SMA foram tentados para serem detectados por western blot, e isso foi feito pela exclusão dos genes smad 3 e BMP-7 e detecção da formação da oligomerização do complexo inflamassoma por o uso da microscopia confocal. Abstract: Fibrosis is considered a complex form of tissue damage commonly present in the end stage of many diseases. It is also related to a high percentage of death, whose predominant characteristics are an excessive and abnormal deposition of fibroblasts and myofibroblasts -derived extracellular matrix (ECM) components. Epithelialto- mesenchymal transition (EMT), a process in which epithelial cells gradually change to mesenchymal ones, is a major contributor in the pathogenesis of fibrosis. The key mediator of EMT is a multifunctional cytokine called transforming growth factor-B (TGF-B) that acts as the main inducer of the ECM assembly and remodeling through the phosphorylation of Smad2/3, which ultimately forms a complex with Smad4 and translocates into the nucleus. On the other hand, the bone morphogenic protein-7 (BMP-7), a member of the TGF family, reverses EMT by directly counteracting TGF-B induced Smad-dependent cell signaling. NLRP3 (NACHT, LRR, and PYD domains-containing protein 3), in turn, acts as cytosolic sensors of microbial and self-derived molecules and forms an immune complex called inflammasome in the context of inflammatory commitments. NLRP3 inflammasome assembly is triggered by extracellular ATP, reactive oxygen species (ROS), potassium efflux, calcium misbalance, and lysosome disruption. Due to its involvement in multiple diseases, NLRP3 has become one of the most studied pattern-recognition receptors (PRRs). Nevertheless, the role of NLRP3 in fibrosis development has not been completely elucidated. Our aim in this research was to study the formation of the inflammasome complex following the induction of EMT by TGF-B in both human and murine renal tubular epithelial cells. For that we tried to transfect the human tubular epithelial cells HK- 2 and the murine ones mm55.k with GFP and Cerulean labeled NLRP3 and ASC inflammatory proteins, respectively. In order to investigate the EMT process, both Ecadherin and ?-SMA were tried to be detected by western blot, and this was done by deleting bothe the smad 3 and BMP-7 genes and detecting the formation of the inflammasome complex oligomerization by the use of the confocal microscopy.
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