Análises in silico, coexpressão e caracterização preliminar de uma nova lipase de Burkholdeira contaminans LTEB11

Abstract

Resumo: Esta dissertação relata análises in silico e a expressão e caracterização de lipase e foldase produzidas por Burkholderia contaminans LTEB11. O trabalho consistiu, na parte in silico, das análises de sequência, modelagem por homologia e análise filogenética; na parte laboratorial, consistiu de ensaios de clonagem, expressão e caracterização de lipase denominada LipE e sua foldase correlata, LifE. As análises de sequência mostraram que os genes lipE e lifE estão localizados dentro de um operon denominado lipEF e a construção do modelo de homologia mostrou que LipE possui a topologia a/p-hidrolase característica de lipases, além de presença de uma "lid " formada pela a-hélice a5. Análises de estrutura secundária demonstraram que LipE apresenta características típicas de lipases, como o pentapeptídeo conservado, a tríade catalítica, no caso de LipE formada pelos resíduos His284, Ser86 e Asp262, além de um sítio de ligação ao Ca2+ e dois resíduos de cisteína, indicando a existência de uma ponte dissulfeto. As análises filogenéticas classificaram LipE na subfamília I.2 de lipases bacterianas, que apresentam a necessidade de uma foldase específica para o correto enovelamento. Ensaios de cross-refolding com foldases relacionadas mostraram que apenas outra foldase produzida por B. contaminans LTEB11, LifBC, foi capaz de ativar LipE. LipE e LifE foram coexpressas usando os vetores pET-28a e pT7-7, respectivamente. A clonagem foi satisfatória, com clones apresentando atividade em placas de Petri contendo tributirina. Entretanto, depois da expressão, o extrato contendo o complexo LipE-LifE apresentou baixa atividade de hidrólise contra ésteres de p-nitrofenila (0,01 a 0,04 U mg-1), e nenhuma atividade contra triglicerídeos em meio líquido, indicando a necessidade de otimização da expressão de LipE para possibilitar sua correta caracterização.

Abstract: This dissertation reports in silico analyses and the expression and characterization of lipase and foldase produced by Burkholderia contaminans LTEB11. The work consisted, in the in silico part, of sequence analysis, homology modeling and phylogenetic analysis; in the laboratory part, it consisted of cloning, expression and characterization assays of a lipase called LipE and its correlated foldase, LifE. Sequence analysis showed that lipE and lifE genes are located within an operon called lipEF and the construction of the homology model showed that LipEhas the a/p-hydrolase fold characteristic of lipases, in addition to the presence of a formed "lid"by the a-helix a5. Secondary structure analyzes showed that LipE has characteristics typical of lipases, such as the conserved pentapeptide, the catalytic triad, in the case of LipE formed byresidues His284, Ser86 and Asp262, in addition to a Ca2+ binding site and two cysteine residues ,indicating the existence of a disulfide bridge. Phylogenetic analyzes classified LipE in the I.2 subfamily of bacterial lipases, which need the presence of a specific foldase for correct folding. Cross-refolding assays with related foldases showed that only another foldase produced by B. contaminans LTEB11, LifBC, was able to activate LipE. LipE and LifE were co-expressed using vectors pET-28a and pT7-7, respectively. Cloning was satisfactory, with clones showingactivity in Petri dishes containing tributyrin. However, after expression, the extract containing the LipE-LifE complex showed low hydrolysis activity against p-nitrophenyl esters (0.01 to0.04 U mg-1), and no activity against triglycerides in liquid medium, indicating the need for optimization of LipE expression to enable its correct characterization.