Análise funcional e regulatória da enzima málica MAEB2 de Azospirillum brasilense

Abstract

Resumo: As enzimas málicas catalisam a decarboxilação oxidativa do malato a piruvato com a redução associada de NAD+ ou NADP+. Em eucariotos, enzimas málicas citoplasmáticas, mitocondriais e plastidiais já foram caracterizadas e apresentam estrutura conservada. Por outro lado, as enzimas málicas procarióticas, que são mais diversas em estrutura, são bem menos caracterizadas. As enzimas málicas tipo MaeB são encontradas em bactérias gramnegativas como Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti e Azospirillum brasilense e possuem uma estrutura multimodular composta por dois domínios característicos, um Nterminal, responsável pela atividade málica, e outro C-terminal com homologia as fosfotransacetilases (PTA), cuja função não é bem esclarecida. Em A. brasilente, são encontradas duas isoformas de proteínas tipo MaeB, uma NADP+-dependente (AbMaeB1), já caracterizada cineticamente, e outra, como demonstrado pelos resultados aqui descritos, NAD+-dependente (AbMaeB2). Estudos anteriores demonstraram que as enzimas tipo MaeB participam de processos metabólicos essenciais, tendo um papel central controlando o destino de carbono no nó metabólico fosfoenolpiruvato / piruvato / oxaloacetato graças a capacidade de responderem aos níveis de diferentes metabólitos. Nesse sentido, no presente trabalho, a enzima málica AbMaeB2 foi purificada e caracterizada a fim de esclarecer o possível papel desta enzima no metabolismo de A. brasilense. Análises de gel-filtração sugerem uma massa molecular aproximada de 696 kDa para AbMaeB2, sendo a massa teórica do monômero estimada em 83 kDa, o que sugere que essa enzima corresponde a um octâmero de alto peso molecular, assim como observado para a proteína MaeB de E. coli (EcMaeB). Os resultados dos ensaios sobre os efeitos de diferentes metais na atividade málica de AbMaeB2 indicam que ambos os metais, Mg2+ e Mn2+, podem ser utilizados como co-fatores por esta enzima, com preferência por Mn2+, o que está de acordo os resultados obtidos em estudos anteriores para a MaeB de E. coli e MaeB1 de A. brasilense. Além disso, a ativação por KCl, anteriormente relatada para EcMaeB e AbMaeB1, também foi observada para AbMaeB2. Através dos ensaios realizados para a determinação dos parâmetros cinéticos, os valores de KM para os substrados da enzima AbMaeB2 foram estimados em 25,4 mM e 21,9 mM para L-malato na presença de NAD+ e NADP+ saturantes, respectivamente, e 0.8 mM para NAD+ e 1,1 mM para NADP+ em concentrações saturantes de L-malato. Por fim, dadods preliminares sobre o efeito de diferentes metabólitos na atividade málica de AbMaeB2 indicam uma possível regulação desta enzima por acetil-fosfato, ATP e ADP.

Abstract: Malic enzymes catalyze the oxidative carboxylation of malate to pyruvate with the associated reduction of NAD+ or NADP+. In eukaryotes, cytoplasmatic, mitochondrial and plastidial malic enzymes have already been characterized and have a conserved structure. On the other hand, prokaryotic malic enzymes, which are more diverse in structure, are much less characterized. Malic enzymes MaeB-like are found in gramnegative bacteria like Escherichia coli, Sinorhizobium meliloti and Azospirillum brasilense and have a multimodular structure composed of two characteristic domains, a N-terminal domain, responsible for malic activity, and another C-terminal domain with homolgy to phosphotransacetylases (PTA), whose function in not well understood. In A. brasilense, two isoforms of MaeB-like proteins are found, the NADP+-dependent (AbMaeB1), already characterized kinetically, and another, as shown by the results described here, NAD+-dependent (AbMaeB2). Previou studies have shown that MaeBlike enzymes participate in essential metabolic processes, playing a central role in controlling the fate of carbon in the phosphoenolpyruvate / pyruvate / oxaloacetate metabolic node due to the ability to respond to the levels of different metabolites. In this sense, in the presend work, the malic enzyme AbMAeB2 was purified and characterized in order to clarify the possible role of this enzyme in the metabolism of A. brasilense. Gel-filtration cromatography analyses suggest a molecular mass of 696 kDa for AbMaeB2. The predicted molecular weight of the MaeB2 polypeptide is 83 kDa, hence, MaeB2 is also likely to be arranged in a high molecular weigh oligomer as observed in E. coli and S. meliloti, likely forming an octamer. The results of tests of metals on the malic activity indicate that Mg2+ and Mn2+ are essential to the malic activity of AbMaeB2, with a preference for Mn2+, in agreement with the results obtained with E. coli MaeB and A. brasilense MaeB1. In addition, KCl activation, previously reported for EcMaeB and AbMaeB1, has also been observed for AbMaeB2. The KM values for the substrates of the AbMaeB2 enzyme were estimated to be 25,4 mM and 21,9 mM for L-malate in the presence of saturating NAD+ and NADP+, respectively, and 0,8 mM for NAD+ and 1,1 mM for NADP+ in saturating concentrations of L-malate. Finally, preliminary data on the effect of different metabolites on the AbMaeB2 malic activity indicate a possible regulation of this enzyme by acetyl-phosphate, ATP and ADP.