Detecção de cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium em biomas marinhos e de água doce : um estudo de monitoramento de dois anos como instrumento para elaboração de proposta de legislação estadual de balneabilidade no Paraná

Abstract

Resumo: A giardiose e criptosporidiose são as protozooses intestinais de veiculação hídrica mais relevantes no âmbito mundial. Ambos os protozoários são frequentemente associados como agentes etiológicos de diarreia em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Atualmente, o contato de recreação primário (imersão total do corpo ou ingestão acidental de água) é considerado uma importante via de transmissão de ambos os protozoários. Contudo, os dados acerca da epidemiologia ambiental de protozoários em áreas costeiras brasileiras ainda são limitados e, a caracterização molecular de protozoários nestes ambientes é ainda mais escassa. Os objetivos deste estudo foram: i) realizar o monitoramento ambiental de protozoários patogênicos e indicadores bacteriológicos de contaminação fecal em praias do litoral do Paraná por um período de dois anos; ii) analisar separadamente a água do mar e a água de corpos hídricos dulcícolas que afluem para estes locais quanto a contaminação por oocistos de Cryptosporidium spp. e cistos de Giardia spp.; iii) verificar a qualidade sanitária de ambos os biomas aquáticos mediante determinação da concentração de Escherichia coli e Enterococcus sp. e iv) analisar e fornecer dados microbiológicos e parasitológicos ao órgão ambiental competente como subsídio para proposição de legislação estadual de balneabilidade. Foram coletadas 144 amostras de água (10L / amostra) mensalmente, de janeiro de 2017 a dezembro de 2018 (n = 24 meses) das praias de Guaratuba, Caiobá e Matinhos (72 amostras de água do mar e 72 amostras de corpos hídricos) para a pesquisa de protozoários patogênicos. As amostras hídricas foram analisadas pela técnica de filtração em membranas com pequenas modificações propostas pelo método 1623.1 (US Environmental Protection Agency). A etapa de eluição das membranas foi realizada mediante raspagem e lavagem com Tween 80 (0,1%) e centrifugadas a 1500 x g / 15 min para obter o sedimento. Alíquotas de 10 ?L de cada sedimento foram utilizadas para confecção das lâminas e a visualização dos protozoários foi realizada por reação de imunofluorescência direta (RID), utilizando anticorpos monoclonais anti-Cryptosporidium e anti-Giardia. A confirmação da morfologia dos protozoários foi realizada por microscopia de contraste de interferência e pela incorporação de DAPI ao material nuclear dos protozoários. Todas as amostras positivas por RID foram submetidas à extração de DNA para realização de PCR. Um fragmento de 530 pb do gene triose fosfato isomerase (tpi) foi amplificado por nested-PCR para Giardia duodenalis, assim como o gene 18S rRNA utilizado como marcador molecular para Cryptosporidium spp, sendo os produtos amplificados submetidos ao sequenciamento. A concentração de indicadores fecais foi enumerada por técnicas microbiológicas convencionais e estimativa do número mais provável (NMP / 100 mL). A ocorrência de ambos os protozoários foi detectada em todas as praias durante o período de dois anos. Pelo menos um protozoário foi detectado em 58,3% (n = 14) meses de amostragem. A praia de Guaratuba apresentou os maiores índices de contaminação por protozoários (n=9) amostras positivas em corpos hídricos e mar, seguida de Caiobá (n=8) e Matinhos (n=7). Do total de amostras positivas, cistos de Giardia spp. foram identificados em 15 (62,5%), Cryptosporidium spp. em sete (29,2%) e ambos os protozoários em duas amostras (8,2%). A contaminação por Giardia duodenalis foi confirmada em duas praias, assim como a presença de Cryptosporidium, detectado pela primeira vez mediante ensaios de biologia molecular em uma área costeira do Brasil. O monitoramento microbiológico evidenciou importante impacto de contaminação fecal em todas as praias, especialmente nos corpos hídricos que afluem para o mar, sendo observada expressiva contaminação no primeiro ano e, redução nas taxas de contaminação no segundo ano de monitoramento. Este é o primeiro relato da ocorrência destes protozoários em áreas recreacionais do estado do Paraná e o primeiro estudo conduzido em diferentes biomas (dulcícolas, salobros e salinos) que compõe áreas costeiras a monitorar conjuntamente a qualidade parasitológica e microbiológica por um extenso período de tempo. Os resultados poderão ser utilizados para nortear estratégias de gerenciamento de áreas costeiras, assim como para a criação de uma legislação estadual de balneabilidade visando à melhoria da qualidade sanitária de praias e a proteção da saúde pública.

Abstract: Giardiasis and cryptosporidiosis are the most relevant waterborne intestinal protozoosis worldwide. Both parasites are frequently associated as the aetiological agents of diarrhea in developing and developed countries. Currently, primary contact recreational (total body immersion or accidental ingestion of water) is clearly an important route of transmission of both protozoa. However, data on environmental epidemiology of protozoa in Brazilian coastal areas are still limited and molecular characterization is even scarcer. The main goals of this study were: i) to perform the environmental monitoring of pathogenic protozoa and bacteriological indicators of fecal contamination on beaches of Paraná coast for a period of two years; to analyze separately seawater and freshwater bodies of water which flows to these sites for contamination by Cryptosporidium spp. oocysts and Giardia spp. cysts; iii) to verify the sanitary quality of both aquatic biomes by enumeration of concentration of Escherichia coli and Enterococcus sp.; and iv) to analyze and provide microbiological and parasitological data to the environment responsible agency as a subsidy for proposing a state balneability legislation. A total of 144 water samples (10 L / sample) were harvested monthly through January 2017 to December 2018 (n = 24 months) from Guaratuba, Caiobá and Matinhos beaches (72 samples of seawater and 72 of water bodies) to search for pathogenic protozoa. Water samples were processed by the membrane filtration technique with minor modifications proposed by 1623.1 method (US Environmental Protection Agency). The membrane elution step was performed by scraping and washing it with Tween 80 (0,1%) being the resulting liquid centrifuged (1500 x g / 15 min) to obtain the pellet. Aliquots of 10 ?L of each sediment were used to make the slides and the visualization of the protozoa was performed by direct immunofluorescence assay (IFA) using Anti-Cryptosporidium and Anti-Giardia monoclonal antibodies. Confirmation of protozoa morphology was performed using differential interference contrast microscopy and by the incorporation of vital dye DAPI to protozoa nuclear material. All samples that were confirmed as positive on IFA were submitted do DNA extraction for PCR analysis. A fragment of 530 bp of the triose phosphate isomerase gene (tpi) was amplified by nested-PCR for Giardia duodenalis, as well as 18S rRNA gene as molecular marker for Cryptosporidium spp., being the amplified products submitted to sequencing reactions. The concentrations of faecal indicators were enumerated by conventional microbiological techniques and estimative of most probable number (MPN / 100mL). The occurrence of both protozoa were detected on all beaches during the two year monitoring period. At least one protozoa were detected in 58.3% (n = 14) months of sampling. Guaratuba was the most contaminated beach with the highest record of parasites on water bodies or seawater sites (n = 9 positive samples), followed by Caiobá (n = 8) and Matinhos (n = 7). From the total of positive samples, Giardia spp. was detected in 15 (62.5%), Cryptosporidium spp. in 7 (29.2%) and both parasites appeared in 2 (8.3%) samples. The contamination by Giardia duodenalis was confirmed on two beaches, as well as the presence of Cryptosporidium, detected for the first time through molecular assays in a coastal area of Brazil. Microbiological monitoring showed an important impact of feacal contamination in all beaches, especially on water bodies that flow into the sea, with significant contamination being observed in the first year and a reduction in contamination rates in the second year of monitoring. This is the first report of the occurrence of pathogenic protozoa on recreational areas of Paraná state, and the first study conducted in different biomes (freshwater, brackish and saline) that composes coastal areas to monitor together parasitological and microbiological quality for an extended period of time. The results may be used to guide coastal area management strategies, and also contribute to elaborate state balneability legislation, aiming the improvement of the sanitary quality of beaches and to safeguard public health.