Desenvolvimento e validação de ensaio in vitro para detecção de vírus rábico residual viável em vacina antirrábica inativada

Abstract

Resumo: A raiva, uma zoonose viral, causa cerca de 60 mil mortes anuais, sendo os cães responsáveis por 99% da transmissão para humanos. No entanto, a raiva humana é prevenível por meio da vacinação de cães e da profilaxia pós-exposição em humanos utilizando vacinas antirrábicas inativadas. Durante sua produção, vários ensaios obrigatórios de controle de qualidade in vivo, como potência, vírus vivo residual e inocuidade são responsáveis pela utilização de grande quantidade de animais. Ao longo dos últimos anos, organizações mundiais têm estimulado o desenvolvimento de métodos alternativos para substituir, reduzir ou refinar a utilização de animais na indústria farmacêutica. Este projeto propõe desenvolver e validar um ensaio in vitro em substituição ao ensaio in vivo para a determinação de vírus vivo residual, combinando técnicas de isolamento viral com leitura por imunofluorescência direta em placa e quantificação viral por método molecular. A padronização das etapas de recuperação viral e quantificação por RT-qPCR foram realizadas e o ensaio combinado mostrou-se 3 vezes mais sensível que o ensaio in vivo. Foi possível identificar amostras de suspensão viral anteriormente liberadas pelo controle interno, com partículas de vírus rábico ainda viáveis, comprovando a importância da implantação deste método no controle interno da produção da vacina antirrábica. Além disso, o ensaio desenvolvido é mais prático, barato e produz resultados mais rapidamente, em apenas 4 dias, o que pode possibilitar maior agilidade no controle de qualidade interno da vacina. O método in vitro poderá reduzir 2/3 da quantidade de animais de laboratórios utilizados para esse fim, uma vez que pode ser implantado no controle de qualidade intermediário da produção da vacina rábica inativada.

Abstract: Rabies, a viral zoonosis, causes nearly 60,000 annual deaths, with dogs accounting for 99% of transmission to humans. However, human rabies is preventable through dog vaccination and pre-exposure prophylaxis in humans, using inactivated rabies vaccines. During their production process, several mandatory in vivo quality control trials, such as potency, live virus and safety are responsible for the use of large numbers of laboratory animals. Over the last few years, global organizations have been encouraging the development of alternative methods to reduce, replace and refine the use of animals in the pharmaceutical industry. This study proposes the development and validation of an in vitro assay replacing the in vivo assay for the determination of residual live virus combining viral isolation techniques with direct immunofluorescence detection and viral quantification by a m olecular method. Standardization of viral recovery steps and quantification by RTqPCR were performed, and the combined method was shown to be 3 fold more sensitive than the in vivo assay. It was possible to identify viral suspensions samples, previously released by the in vivo internal controls, which still had residual viable rabies virus particles, proving the importance to implement this method as an internal quality control of rabies vaccine production. In addition, the assay developed is more practical, cheaper and produces results more quickly, in just 4 days, which may allow greater agility in the internal quality control of the vaccine. The in vitro method may reduce 2/3 of the amount of laboratory animals used for this purpose, since it can be implemented in the intermediate quality control of inactivated rabies vaccine production.