Estrutura cristalográfica do fator de iniciação da tradução EIF4E5 de Trypanosoma cruzi em complexo com o cap-4 do mRNA e estudos de interação entre as homólogas EIF4E de T. cruzi e análogos do cap

Abstract

Resumo: A síntese de proteínas é um dos processos mais regulados pela célula. Os chamados fatores de iniciação da tradução (eIFs) participam da regulação desta etapa através de interações específicas necessárias à maquinaria de tradução. Os tripanossomatídeos possuem várias características moleculares únicas, um exemplo sendo sua maquinaria de síntese proteica. A iniciação da tradução é coordenada por 12 fatores de iniciação. A associação do mRNA ao ribossomo é mediada por um complexo multiproteico e dentre seus componentes está o fator de iniciação eIF4E, que interage especificamente com o chamado cap do mRNA. Uma das particularidades encontradas em tripanossomatídeos refere-se à estrutura do cap do mRNA, denominado cap-4, que possui, além do 7-metil-GTP dos eucariotos, metilações adicionais nos quatro primeiros nucleotídeos do spliced leader. Outra particularidade dos tripanossomatídeos é a presença de seis homólogas eIF4E (chamadas EIF4E1 a 6), que podem estar envolvidas em diferentes complexos pré-iniciação ditos eIF4F-like. Assim, o projeto tem como objetivo estudar os 6 diferentes homólogos de eIF4E de Trypanosoma cruzi e suas interações com análogos do cap. Ensaios de interação entre EIF4E e os análogos do cap foram realizados por termoforese em microescala, além de ensaios de cristalização, que levaram a determinação da estrutura cristalográfica de TcEIF4E5. A estrutura cristalográfica do complexo TcEIF4E5 com os análogos do cap do mRNA revelou detalhes únicos do mecanismo de interação, a estrutura cristalográfica apresentou pela primeira vez a estrutura tridimensional de EIF4E em complexo com cap-4. As análises de interação das construções de EIF4E por termoforese em microescala indicam regiões envolvidas na interação e sugerem papeis diferenciados entre cada homólogo do fator eIF4E em T. cruzi. Palavras chave: Fatores de Iniciação da Tradução, eIF4E, cap-4, Trypanosoma cruzi, Estrutura Cristalográfica de TcEIF4E5.

Abstract: Protein synthesis is one of the most regulated processes in the cell. The so-called translation initiation factors (eIFs) participate in the regulation of this stage through specific interactions, necessary to the translation machinery. Trypanosomatids have several unique molecular characteristics, including their protein synthesis machinery. Translation initiation is coordinated by 12 initiation factors. The association of the mRNA with the ribosome is mediated by a multiprotein complex and among its components is the eIF4E initiation factor, which interacts specifically with the mRNA cap. One of the particularities found in trypanosomatids refers to the mRNA cap structure, called cap-4, which has in addition to the eukaryote 7-methyl-guanosine, additional methylations on the first four nucleotides of the spliced leader. Another particular feature of trypanosomatids is the presence of six eIF4E homologs (called EIF4E1 to 6), which may be involved in different pre-initiation complexes called eIF4F-like. This project aims to study the 6 different eIF4E homologues of Trypanosoma cruzi and their interactions with cap analogs. Interaction analysis between EIF4E and cap analogs were performed by microscale thermophoresis, as well as crystallization assays, which led to the determination of the TcEIF4E5 crystallographic structure. The crystal structures of the TcEIF4E5 in complex with mRNA cap analogues provided unprecedented details on the binding mechanism and revealed for the first time the three-dimensional structure of a trypanosomatid eIF4E in complex with the mRNA cap-4. Interaction analyzes of EIF4E constructs by microscale thermophoresis indicate regions involved in the interaction and suggest different roles between each eIF4E factor homologue in T. cruzi. Keywords: Translation Initiation Factors, eIF4E, cap-4, Trypanosoma cruzi, TcEIF4E5 Crystallographic Structure.